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《四川农业大学》 2012年
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O型口蹄疫病毒纯化及其单克隆抗体的制备

张奕强  
【摘要】:由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus, FMDV)引起的口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease, FMD)是一种烈性、急性、热性、高度接触性的传染病。该病能够感染多种偶蹄家畜,使动物生产性能下降,而且还导致疫区畜产品的上市和出口会受限制,给各个国家及地区的动物贸易带来了巨大的经济损失,因此一直受到世界各国的广泛重视。目前,快速准确地诊断以及切实有效的疫苗是防控口蹄疫的关键。因此,开发更为敏感、快速、准确的诊断试剂对口蹄疫的防控具有十分重要的现实意义。由于单抗具有纯度高、特异性强、重复性好等突出特点,可用于开发新型诊断试剂和各项基础研究。本研究旨在建立一株或几株能够稳定分泌针对O型FMDV的单抗的杂交瘤细胞系,为开发新型诊断试剂和基因工程新型疫苗提供实验材料;同时,也为今后进一步研究O型FMDV抗原结构、表位生物学功能等病原学研究奠定基础。 通过将保存的鼠毒种毒回归乳鼠复壮,利用细胞培养和病毒增殖的方法获得0型FMDV,然后将获得的FMDV进行灭活处理,再经PEG沉淀并浓缩病毒,三氯乙烯脱脂,最后利用蔗糖密度梯度离心法提纯病毒粒子,再通过SDS-PAGE对提纯后的病毒粒子抗原进行纯度检测,同时利用Western-blot进行抗原性分析,结果显示,通过上述方法获得了纯度较高且抗原性好的O型FMDV的完整病毒粒子抗原 利用该抗原通过棋盘滴定法建立间接ELISA,确定该抗原的最佳包被浓度为5.0μg/mL,同时将该抗原通过常规免疫的方式免疫BALB/c小鼠,四次免疫后将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞在PEG1500作用下进行融合,制备杂交瘤细胞。经过间接ELISA筛选和3次单克隆化,获得了1株能分泌抗O型口蹄疫病毒的抗体的单克隆杂交瘤细胞株,并且命名为5F10。并且通过动物体内生产法大量制备了5F10单克隆抗体。 对5F10杂交瘤细胞产生的腹水利用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法进行纯化后,经SDS-PAGE发现,抗体裂解为重链和轻链,分子量分别在50.0kD和25.0kD左右;经过间接ELISA对5F10单克隆抗体效价进行测定,其细胞培养上清效价为1:512,腹水效价为1:25600;经间接免疫荧光和间接ELISA特异性检测发现,5F10单克隆抗体不与正常BHK-21细胞发生反应,与A型、C型和Asia Ⅰ型FMDV也不存在型间交叉反应;抗体亚型测定结果显示,5F10单克隆抗体为IgG1亚型。 O型FMDV侵染BHK-21细胞初步研究表明,应用单抗5F10通过间接免疫荧光检测,O型FMDV感染细胞2h后才能被检测到,病毒仅存在与细胞胞浆中,并且在感染4h后可发现新生病毒粒子突然大量出现。 本研究成功制备了抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体,为今后开发新型诊断试剂和基因工程新型疫苗提供实验材料,也为进一步研究O型FMDV抗原结构、表位生物学功能等病原学研究奠定基础。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S852.65

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 林彤;邵军军;丛国正;独军政;高闪电;常惠芸;谢庆阁;;利用Asia1型口蹄疫病毒VP1蛋白的单克隆抗体建立单抗竞争ELISA方法[J];安徽农业科学;2009年23期
2 卢丽琨;田利源;汪莉;;人源化免疫毒素的研究进展[J];国际药学研究杂志;2009年06期
3 严华,童鲲,申厚风,张跃,陈俊华,诸葛末伊,单秋;制备单克隆抗体的一种新的免疫方法[J];免疫学杂志;1997年02期
4 孙玮;张利宁;;噬菌体抗体库技术研究进展[J];山东医药;2007年14期
5 蔡旭;彭卓醇;孔德升;郭泓珅;白浩;宋后燕;马端;;脾内微量注射免疫法制备抗重组可溶性组织因子单克隆抗体[J];复旦学报(医学版);2006年01期
6 武楠;周丹秋;阮卫;吴丽桂;张慧涨;;小鼠脾内免疫法制备重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体[J];复旦学报(医学版);2010年02期
7 吴雯峰;王双;孙志伟;;噬菌体展示抗体库筛选技术研究进展[J];生物技术通讯;2007年03期
8 刘文明;童德文;李立;邢明辉;赵俊;;抗肿瘤单克隆抗体药物的研究进展[J];西北农林科技大学学报(自然科学版);2006年08期
9 江鹏斐,谢庆阁;应用口蹄疫病毒非结构蛋白区分感染动物和注苗动物[J];中国兽医科技;1999年12期
10 唐海波,童晓辉;欧盟口蹄疫政策发生重大改变[J];中国兽医学报;2003年06期
【共引文献】
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1 张秀美,艾武,王莉莉,宋敏训,牟建青,徐苏云,杨奎,陈溥言;鸡传染性喉气管炎的诊断与病毒分离鉴定[J];山东农业科学;1997年06期
2 沈咏舟,田克恭,杨汉春,遇秀玲;犬呼肠病毒3型感染的血清学调查[J];安徽农业科学;1999年01期
3 沈咏舟,程健整,沈乐平;鸡痘冻干保护剂热稳定性的研究[J];安徽农业科学;2003年05期
4 沈咏舟,沈乐平,程建整;鸡传染性支气管炎病毒冻干保护剂热稳定性研究[J];安徽农业科学;2003年06期
5 沈咏舟,沈乐平,程建整;鸡新城疫病毒耐热冻干保护剂的研究[J];安徽农业科学;2004年02期
6 沈咏舟;潘鑫;郑新勇;;猪源性新城疫病毒的分离与鉴定[J];安徽农业科学;2006年19期
7 朱琪;姜国均;;中药“三仙保健散”对肉仔鸡免疫功能的影响[J];安徽农业科学;2010年23期
8 张小飞,苏根元,解启发,胡晓苗,范如龙;减蛋综合征AQ毒株的分离与鉴定[J];安徽农业科学;1997年02期
9 刘和杰,张训海,刘素梅;小鹅瘟琼扩抗原的制备[J];安徽技术师范学院学报;2001年03期
10 丁利;方振华;梁宏德;郭伟娜;焦喜兰;王平利;杨玉荣;;一例疑似黏膜病死亡麋鹿消化及主要免疫器官病理组织学观察[J];动物学杂志;2008年02期
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1 詹爱军;覃健萍;刘忆云;马静云;曹永长;毕英佐;;口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因的基因克隆与序列测定[A];第一届中国养猪生产和疾病控制技术大会——2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集[C];2005年
2 王建新;崔治中;张纪元;王增福;陈本龙;王锡乐;;J亚群禽白血病病毒与禽网状内皮增生症病毒共感染对肉鸡生长和免疫功能的抑制作用[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会鸡淋巴白血病防控技术研讨会论文集[C];2010年
3 孙淑红;柴家前;王波;孙洪磊;王晓云;崔治中;;表现腺胃炎的蛋用型鸡J亚群-白血病病毒的分离与鉴定[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会鸡淋巴白血病防控技术研讨会论文集[C];2010年
4 商营利;刘思当;丁宝君;肖一红;成子强;孙先明;褚艳丽;;鸡感染J亚群禽白血病病毒的免疫抑制机理[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会鸡淋巴白血病防控技术研讨会论文集[C];2010年
5 王君敏;胡元亮;王德云;张靖;刘静;;硫酸化修饰提高枸杞多糖增强免疫活性的研究[A];中国畜牧兽医学会2010年学术年会——第二届中国兽医临床大会论文集(上册)[C];2010年
6 秦韬;胡元亮;王德云;张靖;;硒化修饰提高当归多糖免疫增强活性的研究[A];生态环境与畜牧业可持续发展学术研讨会暨中国畜牧兽医学会2012年学术年会和第七届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会会议论文集——T04家畜健康养殖模式专题[C];2012年
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1 王乃东;鼠源性高亲和力H-Y噬菌体Fab抗体的筛选与早期胚胎性别鉴定[D];湖南农业大学;2010年
2 刘晓丽;I型鸭肝炎病毒中国流行株生物学特性相关研究[D];中国农业科学院;2011年
3 于淼;山东鸡新城疫病毒分离鉴定与Ⅱ+Ⅶ基因型灭活疫苗研究[D];南京农业大学;2009年
4 张源淑;酪啡肽的鉴定及其对仔猪消化道功能的影响研究[D];南京农业大学;2004年
5 付朝阳;J亚群禽白血病病毒分离株变异分析及重组抗原ELISA检测方法的建立[D];中国农业科学院;2004年
6 唐勇;猪伪狂犬病鉴别诊断研究与猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组序列的测定[D];华中农业大学;2004年
7 刘思当;鸡J亚群白血病病毒与网状内皮增殖病病毒混合感染发病机理的研究[D];中国农业大学;2005年
8 易建中;抗A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒重组双价多肽疫苗研究[D];复旦大学;2005年
9 郭慧君;不同免疫抑制病毒感染及其共感染对鸡细胞免疫反应的影响[D];山东农业大学;2006年
10 任林柱;口蹄疫病毒反向遗传技术体系及分子标记疫苗株的构建[D];吉林大学;2007年
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1 颜赟;鸡免疫抑制性病毒共感染的流行病学调查[D];山东农业大学;2010年
2 张振杰;皖南黄肉种鸡ALV-J与REV的共感染及其分子变异分析[D];山东农业大学;2011年
3 王峰;J亚群禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒单克隆抗体的研制[D];山东农业大学;2011年
4 杨凤;山东地区禽白血病发病鸡群的流行病学调查及致病特性的研究[D];山东农业大学;2011年
5 陈启伟;口蹄疫A型病毒AF/72株主要B细胞表位的筛选鉴定[D];甘肃农业大学;2010年
6 娄慧;口蹄疫A型病毒A/WH/09株结构蛋白主要B细胞表位的筛选及鉴定[D];甘肃农业大学;2011年
7 王珊;鸭源鸡杆菌抗体消长规律研究及抗脂多糖单抗杂交瘤细胞株的建立[D];河南农业大学;2011年
8 侯艳红;法氏囊活性肽的制备与应用[D];河北农业大学;2001年
9 董冰;EGF-PE40单克隆抗体制备、纯化研究及EGF-PE40抗原性的初步鉴定[D];中国人民解放军军需大学;2001年
10 覃广胜;伪狂犬病病毒广西B、W株gE基因的扩增、克隆及序列分析[D];广西大学;2002年
【二级参考文献】
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1 纪方,苗积生,史丽梅,沈茜,陈永裕,陈舰;~(90)Y标记OSMcAb的研究[J];第二军医大学学报;2000年02期
2 郭庆东,章翔,费舟,赵爱志,王彦刚,吴景文,李侠,张永琴;大库容量人源性天然单链抗体库的构建[J];第四军医大学学报;2001年23期
3 林乔,何敏,李川江,冯玲玲,章咏裳,李龙承;抗人膀胱癌单克隆抗体与阿霉素偶联物的理化特性[J];湖北预防医学杂志;1997年03期
4 于俊峰,尹端沚,汪勇先;用于放免治疗单克隆抗体的研究进展[J];核技术;2002年05期
5 陆荫英,王琳,刘妍,于敏,李克,张玲霞,王业东,成军;乙型肝炎病毒表面抗原单链抗体细胞内免疫抗乙型肝炎病毒基因治疗研究[J];军医进修学院学报;2003年01期
6 葛棣,曾亮,葛锡锐,林斯骏,钟高仁,朱建华;~(90)钇标记单克隆抗体LC1对荷肺癌裸鼠局部放射免疫治疗[J];复旦学报(医学版);2003年02期
7 王飞,董军,黄强;转基因完全人抗体的制备及其抗肿瘤作用研究[J];中华神经外科疾病研究杂志;2002年01期
8 洪龙,杨柏成,朱圣庚;轮换淘选法筛选凝血酶特异的噬菌体抗体[J];微生物学通报;2005年03期
9 王刚,王琰,化冰,刘晓琳,乔媛媛;人源性天然抗体库的构建及初步鉴定[J];细胞与分子免疫学杂志;2002年01期
10 康晓平,熊伟,常国辉,祝庆余;人源抗SARS病毒噬菌体抗体库的构建及筛选[J];细胞与分子免疫学杂志;2005年01期
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1 郑敏,金宁一,鲁会军,韩松,李昌,金扩世;C型口蹄疫病毒VP1基因的串联与原核表达[J];中国生物制品学杂志;2005年05期
2 李云峰,达来,孙薛蔚,谢秀杰,江晓勇;口蹄疫病毒抗原表位的编码序列在大肠杆菌中表达[J];内蒙古大学学报(自然科学版);2002年03期
3 陈祖欢,张洪英,郭瀛军,林懿,朱维佳,孙树汉;口蹄疫病毒融合表位基因在pET原核系统的高表达及产物的纯化[J];第二军医大学学报;2003年08期
4 田纯见,曹永长,毕英佐;口蹄疫病毒泛亚株全衣壳基因克隆和序列结构分析[J];华南农业大学学报(自然科学版);2004年02期
5 杜以军,姜平,杨晓玮,汤景元,李玉峰,李永东;猪口蹄疫病毒多抗原表位重组腺病毒的构建与鉴定[J];中国病毒学;2005年05期
6 林小敏;孙彦伟;余业东;罗满林;林绍荣;贺东生;;口蹄疫病毒R株基因组序列分析研究[J];华南农业大学学报(自然科学版);2006年02期
7 郎需龙;路浩;王兴龙;党源;王英超;唐婕;崔丽谨;孙春晖;;口蹄疫病毒对树突状细胞感染能力的研究[J];现代畜牧兽医;2009年06期
8 于永忠;赵磊;周国辉;徐香玲;于力;;O型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及生物学特性分析[J];黑龙江畜牧兽医;2009年04期
9 贾俊涛;陈立军;赵明秋;琚春梅;吕英然;陈金顶;;口蹄疫病毒VP1基因siRNA重组腺病毒的构建及其介导的RNAi抑制口蹄疫病毒复制的研究[J];中国兽医杂志;2010年01期
10 刘永杰;张克山;尚佑军;刘湘涛;;口蹄疫病毒前导白蛋(L~(pro))功能最新研究进展[J];中国人兽共患病学报;2011年01期
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1 杨鑫;王红宁;周英顺;高荣;曾博;徐昌文;丁梦蝶;;猪源O型口蹄疫病毒分离株VP1基因特征分析[A];四川省动物学会第九次会员代表大会暨第十届学术研讨会论文集[C];2011年
2 邬苏晓;刘镇明;罗满林;戚一达;;口蹄疫病毒3ABC基因的原核表达[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集(上)[C];2003年
3 邱杨;肖性龙;刘建丽;李惠芳;张经纬;余以刚;吴晖;;口蹄疫通用型实时荧光RT-PCR检测方法的建立[A];中国畜牧兽医学会2009学术年会论文集(下册)[C];2009年
4 潘群兴;王永山;何孔旺;欧阳伟;王晓丽;诸玉梅;夏兴霞;;重组口蹄疫病毒T细胞表位基因的猪细小病毒VP2蛋白病毒样颗粒的构建[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第二次学术研讨会论文集[C];2010年
5 李夏莹;王建昌;郑世军;;口蹄疫病毒VP1,2C蛋白与宿主细胞相互作用机制的研究[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
6 张洪勇;金宁一;;口蹄疫病毒RNA组成、功能及分子致病机制的研究进展[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集(下)[C];2003年
7 鲁会军;韩松;郑敏;贾雷立;王凯;金宁一;;口蹄疫病毒3AB基因在重组杆状病毒中的表达及检测[A];人畜共患传染病防治研究新成果汇编[C];2004年
8 张洪勇;金宁一;;口蹄疫病毒分子流行病学的研究进展[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集(下)[C];2003年
9 郑敏;金宁一;张洪勇;刘棋;韦婷;郭建刚;李华明;尹革芬;鲁会军;;口蹄疫病毒O/NYOO株的分子生物学特性研究[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集(下)[C];2003年
10 郝雪梅;;口蹄疫流行病学及防制措施[A];中国畜牧兽医学会2008年学术年会暨第六届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集[C];2008年
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1 吴星;口蹄疫对农产品市场的影响[N];期货日报;2005年
2 江南雪舞;谈谈口蹄疫病毒[N];大众卫生报;2005年
3 廖学时;构建感染性口蹄疫病毒粒子成功[N];医药导报(中药报);2004年
4 河北省畜牧兽医站 韩庆安(高级兽医师);春防牲畜口蹄疫[N];河北科技报;2006年
5 罗学宏;“手足口病”不是“口蹄疫”[N];家庭医生报;2007年
6 本报记者 刘丁;口蹄疫阴影下的“英国病人”[N];华夏时报;2007年
7 ;猪口蹄疫病的诊治[N];中国畜牧兽医报;2008年
8 刘书梅;春季应做好猪口蹄疫的防治工作[N];河南科技报;2007年
9 刘晔;“山羊绒洗净因素对口蹄疫病毒影响”通过鉴定[N];中国国门时报;2008年
10 郭林;口蹄疫扩大:欧盟对英出口亮红灯[N];光明日报;2007年
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1 陈豪泰;口蹄疫基因工程病毒拯救及其舌下免疫研究[D];甘肃农业大学;2012年
2 李勇;口蹄疫病毒3C(D)蛋白与宿主细胞因子Fascin-1相互作用研究[D];武汉大学;2010年
3 孙萌;口蹄疫病毒VP1抗原基因在模式植物叶绿体中的重组和表达[D];浙江大学;2003年
4 张虎;口蹄疫病毒持续感染BHK-21细胞的转录调控研究[D];武汉大学;2013年
5 吴雨霞;口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因在原核和真核细胞中的表达[D];甘肃农业大学;2003年
6 朱远茂;表达口蹄疫病毒结构蛋白VP1重组牛疱疹病毒1型的构建及其免疫研究[D];东北农业大学;2010年
7 张艳;Asial型口蹄疫病毒宿主嗜性变异的分子基础[D];中国农业科学院;2013年
8 邵寒娟;A、O型口蹄疫双价疫苗研究[D];厦门大学;2004年
9 白兴文;我国O型泛亚1系口蹄疫病毒表型差异的分子基础[D];中国农业科学院;2012年
10 洪琦;口蹄疫—伪狂犬病二价与口蹄疫—猪细小—伪狂犬病三价基因工程疫苗的研究[D];华中农业大学;2005年
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1 张先锋;口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC、3AB、3A的克隆表达及3A蛋白间接ELISA方法的初步建立[D];新疆农业大学;2010年
2 裴志花;牛O型口蹄疫病毒内蒙古疫苗株p1基因的克隆与序列分析[D];内蒙古农业大学;2005年
3 金华利;口蹄疫病毒vp1体外表达和DNA疫苗免疫效果的研究[D];新疆大学;2004年
4 孙琳;MUC1肿瘤抗原和口蹄疫病毒抗体检测方法的建立[D];吉林大学;2004年
5 王钢;口蹄疫病毒VP1基因的序列分析及巢式PCR检测研究[D];四川农业大学;2005年
6 田飞鹏;杆状病毒介导O型口蹄疫病毒P12A和3C基因在Sf9细胞和BHK细胞中的共表达[D];西北农林科技大学;2010年
7 杜宇;猪O型口蹄疫病毒VP_1基因的原核表达及重组蛋白的反应原性检测[D];山西农业大学;2005年
8 赵磊;抗口蹄疫病毒单克隆抗体的制备和抗原模拟表位的筛选[D];安徽农业大学;2008年
9 徐宗香;口蹄疫病毒VP2蛋白B细胞线性表位的鉴定[D];东北农业大学;2009年
10 孙晓智;口蹄疫病毒环介导等温扩增检测方法的建立与评价[D];内蒙古农业大学;2007年
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