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《四川农业大学》 2012年
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银耳菌液体发酵工艺优化及卵孢菌素鉴定

何钢  
【摘要】:银耳多糖是银耳(Tremella fuciformis)的主要生物活性成分,具有增强免疫,抗肿瘤,抗炎症,降血糖、血脂,抗氧化等功能。通江银耳是四川道地药食两用真菌,是银耳中的上品。但是多年来,通江银耳产量一直未能提高,分析原因在于,自然生长的银耳出耳前菌丝会代谢一种红色或者黄色物质,未代谢红色或黄色物质的菌丝体则不出耳;以及通江银耳的伴生菌菌种退化,选育优良伴生菌工作滞后。采用袋料生产难以控制通江银耳子实体的品质,而现代生物发酵技术既能保证活性成分质量,又能进行工业化生产缩短生产周期,节约成本,是解决通江银耳生产面临问题的一种有效方式。但是对通江银耳菌进行液体深层发酵的研究几乎为零,目前,银耳菌其他种的液体发酵所用培养基成分复杂,不利于产物的后续处理,发酵废液对环境危害也较大。发酵过程中随着培养成分的改变,银耳菌不仅代谢产生多糖,同时也会代谢一种红色化合物。文献报道,在银耳出耳前菌丝会代谢一种红色或者黄色物质的现象,未代谢红色物质的菌丝体则不出耳。因此,银耳菌丝产生的红色物质应为银耳生活史所特有的机制。探讨该物质的产生原因及化学结构,对于研究银耳菌的生长机制具有重要意义。但是,该物质的化学结构及其对银耳出耳的作用未见文献报道。 因此,研究通江银耳液体发酵工艺以及发酵获得的银耳多糖的理化性质、生物活性,以及银耳菌代谢产生红色物质的化学结构和功能,对银耳多糖通过液体发酵工业化生产以及银耳出耳的机制研究具有重要意义。本文以发酵目标产物的量为指标,结合目标产物的活性检测,开展全合成培养基液体培养通江银耳菌,并发酵工艺进行优化和对通江银耳菌液体发酵代谢产生红色物质的分离与结构鉴定等两方面的研究。 一、通江银耳全合成培养基液体发酵工艺优化 在发酵参数筛选结果基础上,对通江银耳全合成培养基液体发酵工艺进行优化,实验结果如下:发酵周期为6d时菌丝体和胞外多糖产量达到最大值;最适菌丝体生长及胞外多糖分泌的碳源分别是葡萄糖和乳糖,复合氮源分别是牛肉膏和酸水解酪蛋白。菌丝体和胞外多糖产量最高的初始pH值分别为pH6.0和pH7.0;菌丝体和胞外多糖产量高的发酵温度为25℃;发酵罐扩大培养最佳转速为150r/min;接种量为10%,菌龄2d。适宜通江银耳菌丝体生长的最佳氨基酸是浓度为0.6%的谷氨酸和甘氨酸(1:1)组合,添加浓度为0.4%的甘氨酸和丝氨酸(1:1)组合,适宜胞外多糖的分泌的最佳氨基酸是浓度为0.6%的谷氨酸和甘氨酸(1:1)的组合。对产菌丝体的最佳工艺进行验证,菌丝体产量达12.32±0.15g/L,胞外多糖的产量达5.94±0.27g/L,菌丝体干重和胞外多糖的产量均比未优化前产量高。 二、银耳菌丝体水溶性多糖和胞外多糖的分离 对发酵获得菌丝体和胞外多糖进行提取分离,测定菌丝体多糖(IPS)和胞外多糖(EPS)的单糖组成和相对分子质量大小。实验结果如下:1、通过响应面法建立了菌丝体多糖提取工艺,模型优化结果是提取温度为89.19℃,料液比1:19.07,提取时间5.29h。2、采用脱蛋白、离子交换层析和分子筛凝胶层析方法,从IPS中分离出2个组分命名为IPS1和IPS2,从EPS中分离出2个组份命名为EPSl和EPS2。经HPLC-RID分析EPS2为单一峰,相对分子质量为420602Da,同时采用PMP柱前衍生的方法测定了所获得的各个组份的单糖组成,IPS1由甘露糖,半乳糖,葡萄糖,鼠李糖组成其摩尔比为93.7:47.3:37.4:1,IPS2由甘露糖,鼠李糖,葡萄糖醛酸,葡萄糖,半乳糖组成,其摩尔比为:45.8:1:6.4:18.9:32.2,EPS1由甘露糖,半乳糖,葡萄糖,鼠李糖组成,其摩尔比为:93.7:47.3:37.1:1,EPS2检测出含有甘露糖,半乳糖,葡萄糖,鼠李糖,葡萄糖醛酸,其摩尔比为:2.4:2.7:6.4:1:33.7。 三、银耳菌代谢产生红色物质—卵孢菌素的分离与鉴定 银耳在由菌丝体向子实体转变的过程中会代谢产生红色物质,分离鉴定该化合物的结构,探讨该化合物在银耳产生子实体过程中的作用,为研究银耳的出耳机制奠定化学物质基础,同时对该化合物进行了生物活性研究以便对其开发利用。利用液体发酵技术筛选银耳菌代谢红色物质的培养条件,采用多次柱层析分离方式获得银耳菌代谢产生的红色物质单体,并对该单体进行X-单晶衍射分析,确定其结构为卵孢菌素。根据卵孢菌素的结构特点以及文献报道,通过动物实验测试了其活性。结果如下:1、首次通过对碳氮源的筛选,找到合适的液体深层发酵的方法使银耳菌代谢产生卵孢菌素,浓度为2%的麦芽糖作为碳源,浓度为0.5%豆粕浸出液作为氮源,发酵2-3d,银耳菌开始代谢卵孢菌素。2、采用D101大孔树脂静态吸附卵孢菌素,结果显示卵孢菌素能够被吸附在树脂上,采用70%的乙醇可将卵孢菌素洗脱下来,洗脱液经过浓缩,低温处理可以获得橙红色晶体。通过X衍射的方法鉴定其结构为卵孢菌素。 四、银耳菌丝体水溶性多糖和胞外多糖及卵孢菌素的活性鉴定 1、体外抗氧化的实验结果表明银耳菌丝体水溶性多糖(IPS)活性高于胞外多糖(EPS)活性,IPS2抗氧化活性高于IPS1,EPS2抗氧化活性高于EPS1,体外抗肿瘤活性实验表明,IPS和EPS粗多糖浓度为50mg/mL时在体外具有较强的抑制HeLa细胞的生长的能力。获得性抑郁模型小鼠行为实验中,胞外多糖(EPS)在浓度为100mg/kg的剂量时能显著降低小鼠悬尾测试实验(TST)和小鼠强迫游泳实验(FST)的一动不动时间,在自主活动的实验中没有明显的精神刺激作用,结果显示通江银耳菌发酵获得胞外多糖(EPS)具有抗抑郁样的活性。2、银耳菌产生的卵孢菌素对获得性抑郁模型小鼠行为影响实验结果表明,50mg/kg和25mg/kg两个剂量下都具有降低TST和FST实验小鼠一动不动的时间,25mg/kg剂量组具有降低兴奋度作用,50mg/kg剂量组没有明显升高自主活的次数,结果显示卵孢菌素具有抗抑郁活性。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S567.34

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