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《四川农业大学》 2015年
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柳枝稷根及维管束组织特异性启动子的分离鉴定

许文志  
【摘要】:柳枝稷(Panicum virgatum L.)是原产北美及中美洲部分地区的C4暖季型多年生草本植物,因其具有:生物质产量高、基因组信息资源丰富、水肥利用率高、抗性强、能适应边际性土壤等优势使之成为木质纤维素类能源植物的模式植物之一。截止目前,已经有RNAi、基因超表达等多种基因工程手段被用于柳枝稷的遗传改良。在现有的技术条件下,柳枝稷的遗传改良工程离不开高效稳定的再生体系,以及可以驱动外源基因表达或调控柳枝稷基因表达模式的启动子。现阶段柳枝稷遗传转化最常用的组成型启动子虽然可以驱动目的基因在转化植株中表达,但会过度消耗细胞内的物质和能量,引起植株矮化等一些负面效应。因此寻找柳枝稷自身有效的组织性启动子很有必要。本研究以改良柳枝稷的再生体系、分离鉴定柳枝稷根及维管束特异性启动子为研究目标,以柳枝稷成熟种子为外植体,采用两步法灭菌,并以MS培养基为基础培养基,构建了柳枝稷高效再生体系。此外,还通过生物信息学分析、real-time及RT-PCR验证、巢式PCR及genomewalking克隆、启动子序列分析及5'系列缺失分析、水稻及柳枝稷遗传转化等步骤后,最后通过组织化学染色验证,分离鉴定了柳枝稷两个根特异性启动子及一个维管束特异性启动子,主要结果如下:1.建立了柳枝稷稳定高效的再生体系:采用两步法灭菌种子,用70%乙醇处理20s,再用0.1%HgCl2处理5 min。之后,以MS培养基为基本培养基,添加5 mg·L-12,4-D与1.2 mg·L-1 6-BA进行愈伤组织诱导,添加0.5 mg·L-1GA3再生。该体系污染率低,出愈率高,可获得大量再生植株。2.通过同源比对,在柳枝稷基因组中发现了一个小基因家族PvRCc3,后经RT-PCR 及 real-time PCR 证实,其家族成员 PvRCc3.1、PvRCc3.2及PvRCc3.3 为柳枝稷根特异性表达的基因。随后,通过巢式PCR克隆了 PvRCc3.2及PvRCc3.3的启动子区域,并且克隆了 PvRCc3.3的4个5'系列缺失启动子。结果表明,由于数据库序列拼接错误,PvRCc3.1的启动子序列通过genome walking等技术均无法克隆,因此PvRCc3.1基因及其启动子序列有待进一步研究证实。3.通过LR反应,将PvRCc3.2、PvRCc3.3及其4个5'系列缺失启动子构建到了pMDC162表达载体上以驱动Gus基因,并且用于转化水稻及柳枝稷。转化植株的GUS染色发现:PvRCc3.2、PvRCc3.3及其系列缺失启动子所驱动的Gus基因在转基因水稻中并不是根特异性的表达,转化柳枝稷后虽然可得到状态良好的抗性愈伤,但对所有植株的GUS染色并没有发现蓝色。因此,本研究结果表明PvRCc3.2及PvRCc3.3的序列信息及其启动子的功能还需要进一步的研究。4.采用同样的研究方法,本研究还发现了柳枝稷维管束特异性profilin基因PvPfn2,通过RT-PCR及real-time PCR验证其表达模式后,克隆了 PvPfn2基因1715bp的启动子区域,以及1313bp、958 bp、712 bp及413 bp的4个5'系列缺失启动子。5.GUS染色结果发现:PvPfn2基因的启动子PvPfn2p可驱动Gus基因在转基因水稻的雄蕊、外稃内稃、节、节间、叶片、叶鞘、不同时期的种子以及根等组织器官的维管束中特异性表达,且其表达不受植物生长发育的影响;此外,PvPfn2的4个系列缺失启动子同样可以驱动Gus维管束特异性的表达。因此,PvPfn2p及其系列缺失启动子均可用于柳枝稷等单子叶植物的维管束特异性基因工程改良。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S578

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