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四川地区1株虹鳟(Oncorhynchus mykiss)源传染性造血器官坏死病毒的分离鉴定

余泽辉  
【摘要】:2013年,四川成都彭州某冷水鱼养殖场虹鳟暴发一种流行性传染病,具有发病率和死亡率高的特点(幼鱼和鱼苗死亡率分别高达40%和80%)。对送检样品进行剖解和组织病理学观察。典型表观临床症状表现为体色发黑,腹部膨大,体表多处出现瘀点,病程长的病鱼肛门到尾鳍基部大面积出血,吻部溃烂、出血,部分病鱼眼眶充血,肛门处流出淡黄色粘液便。剖解后可见膘膜、腹膜、心包膜、脑膜、脂肪组织严重点状出血,肝脏发白,脾脏发黑肿大,肾脏肿大、淤血,部分病鱼可见心脏出血点,胃胀气膨大,肠道呈明显的出血性-卡他性炎,肠壁变薄,剖开胃和肠道可见透明淡黄色粘液。组织病理学观察发现头肾、肾、肠道、脾和肝脏等器官的损伤非常显著。典型病理变化表现为头肾实质大面积变性、坏死:肾小管上皮细胞变性、坏死、脱落,间质造血组织坏死:肠道肠粘膜上皮细胞变性、坏死、脱落,粘膜下层聚集大量坏死的嗜酸性颗粒细胞;脾广泛变性、坏死,巨噬细胞侵润,肝细胞变性,坏死形成局灶性的坏死灶,并在肝细胞胞浆发现包涵体。其临床症状和典型的病理组织损伤与传染性造血器官坏死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV)感染类似。参照Williams等的方法合成三对检测虹鳟病毒性疾病的引物,针对IHNV、传染性胰腺坏死(infectious pancreatic necrosis virus, IPNV)与出血性败血症病毒(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)的多重RT-PCR检测显示自然发病鱼为IHNV阳性,测序后的扩增产物与GenBank中进行Blast比对,扩增序列与IHNV核蛋白(Nucleoprotein, N)基因同源性为99.9%。取病鱼的肝、脾组织研磨过滤菌后接种到鲤鱼上皮瘤细胞(epithelioma papulossum of carp, EPC),盲传3代出现典型的坏死,脱落,形成空斑等细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)。并将病变细胞悬液腹腔注射20尾健康虹鳟,注射组均表现为急性死亡(累计死亡率=75%),试验鱼出现与自然发病鱼相同的症状而对照组无异常。提取病变细胞和人工感染病毒的RNA进行多重RT-PCR鉴定,结果显示位于约371bp处均可见特异性DNA扩增条带,与IHNV预期大小一致。本节利用鲤鱼上皮瘤细胞从患病虹鳟分离了一株传染性造血器官坏死病毒,命名为LQN131107,经人工感染试验和多重RT-PCR鉴定进一步确定该病的病原是IHNV。参考GenBank中IHNV核蛋白基因开放阅读框(open reading frame, ORF)的序列(登录号:KJ441078)设计引物,RT-PCR扩增获得IHNV-LQN131107株核蛋白全长基因.纯化后克隆至pMD19-T载体中进行序列测定。生物信息学分析结果显示:IHNV-LQN131107株核蛋白基因的序列长度为1176bp,编码391个氨基酸残基,富含亮氨酸(11.80%)、丙氨酸(10.50%)、谷氨酸(9.50%)、甘氨酸(9.20%);包含1个保守结构域,为Rhabdo_ncap_2;核蛋白不含有信号肽,不存在跨膜区,亲水性大于疏水性;抗原表位预测结果显示其抗原性良好;修饰位点预测显示,存在1个潜在的N-糖基化位点、3个潜在的O-糖基化位点和18个潜在的磷酸化位点。参照Kolodziejek等的方法合成一对扩增部分糖蛋白基因的引物,RT-PCR扩增获得糖蛋白基因,纯化后克隆至pMD19-T载体中进行序列测定。通过软件构建糖蛋白“Mid-G”基因区域的系统发育树发现,LQN131107株与亚洲分离株聚为一簇,均属于JRt基因型;同源性分析表明该分离株与日中国株、日本株和韩国株具有相对最高核酸同源性。同时将核蛋白基因构建系统发育树结果显示LQN131107株与中国近年分离的IHNV株聚为一簇,也属于JRt基因型。


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