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《四川农业大学》 2016年
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苋色蔾CaNHO1基因的克隆与抗病毒功能研究

严文  
【摘要】:植物病毒病害是影响植物生长繁殖的重要病害之一。烟草花叶病毒是帚状病毒科烟草花叶病毒属病毒,主要侵染烟草及其它茄科植物。黄瓜花叶病毒是雀麦花叶病毒科黄瓜花叶病毒属病毒,可以侵染多种单子叶植物以及双子叶植物,并且在世界范围内均有分布。烟草花叶病毒与黄瓜花叶病毒是造成植物病毒病害的最重要的两种病原病毒,每年都会导致严重的农业生产损失。由于病毒的结构和生物学特性相对特殊,传统的防治方法取得的效果不佳。目前,利用基因工程的方法,培育转基因抗病毒植物品种已成为防治植物病毒病害的重要手段之一。抗病基因的研究是植物抗病基因工程的基础。非寄主抗性是植物对绝大多数潜在病原微生物所具有的非专化型抗性,是植物最普遍也是最重要的抗病形式,而且具有稳定持久广谱的抗性特点,在作物抗病育种中具有重要的潜在的利用价值。拟南芥AtNHO1基因就是一个非寄主抗性基因,可受鞭毛蛋白等病原相关分子的诱导表达,编码一种甘油激酶,可调节拟南芥的甘油代谢,参与拟南芥对丁香假单胞菌番茄致病变种等寄主病原菌的抗性,也参与拟南芥对丁香假单胞菌菜豆致病变种等非寄主病原菌的抗性。但是,关于拟南芥AtNHO1基因及其同源基因对植物病毒的抗性的研究报道仍然较少。本研究从广谱抗病毒植物苋色蔾中克隆了与拟南芥AtNHO1基因同源的CaNHO1基因。利用cDNA末端快速扩增技术即RACE技术获得了苋色蔾CaNHO1基因的全长cDNA序列,并进行了核苷酸序列分析以及氨基酸序列分析;利用实时定量PCR技术分析了苋色蔾在分别接种烟草花叶病毒与黄瓜花叶病毒后,CaNHO1基因的表达量变化情况;利用根癌农杆菌介导的遗传转化方法获得了转CaNHO1基因的烟草与番茄植株;最后,通过酶联免疫吸附测定技术即ELISA技术检测了转CaNHO1基因T_1代烟草植株分别对烟草花叶病毒与黄瓜花叶病毒的抗性,以求揭示苋色蔾CaNHO1基因的抗病毒功能。具体研究结果如下:1)核苷酸序列比对分析发现,苋色蔾CaNHO1基因与甜菜等其他物种的同源基因的序列一致性达75%以上,并推测苋色蔾CaNHO1基因编码一种甘油激酶。由核苷酸序列推导得到氨基酸序列并进行蛋白结构预测与分析,发现苋色蔾CaNHO1基因编码蛋白具有FGGY碳水化合物激酶家族的N端和C端保守结构域。2)实时定量PCR分析结果显示,CaNHO1基因在苋色蔾分别接种烟草花叶病毒与黄瓜花叶病毒后表达量均明显上调,表明苋色蔾CaNHO1基因在诱导产生防御反应以抵抗外来病毒入侵过程中可能具有重要作用。3)通过In-Fusion方法构建了pBI121-CaNHO1植物表达载体,并利用农杆菌介导法转化获得了15株转基因烟草与3株转基因番茄。利用卡那霉素对15个T_1代转基因烟草株系分别进行筛选时,进一步确定了5个阳性转基因烟草株系。4) ELISA抗病毒检测发现,部分转CaNHO1基因烟草株系能够延缓烟草花叶病毒的早期侵染以及黄瓜花叶病毒的晚期侵染,表明苋色蔾CaNHO1基因具有一定的抗病毒功能。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q943.2

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