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《四川农业大学》 2016年
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伪狂犬病毒的分离鉴定及gI/gE双基因缺失株的构建

刘小琬  
【摘要】:伪狂犬病(Pesudorabies virus.PRV)又称奇痒症,是由伪狂犬病毒引起的多种家畜和野生动物以发热、奇痒(猪除外)、脑脊髓炎和神经系统症状为主要特征的高度接触性传染病。猪是其天然宿主、储存宿主和传染源,可垂直传播,也可通过消化道、相互接触而传播。目前在全世界广泛流行,给全世界养猪业带来巨大的经济损失。2011年前后,我国多地区接种过Bartha K61基因缺失疫苗的猪场暴发了疑似PR疫情,造成新生仔猪死亡率高,母猪流产、产死胎等,给各地养猪业带来了巨大的经济损失。本试验从四川某接种过疫苗后,出现大规模新生仔猪死亡疑似PR感染的猪场仔猪脑组织样品中成功分离到一株PRV野毒株,将其命名为PRV-XJ株。将其接种于BHK-21细胞,30h后细胞出现聚集、收缩、变圆、拉网、折光性增强、成片脱落等典型的细胞病变,将其进行5轮蚀斑纯化后,进行了一系列的生物学鉴定和部分生物学特性分析。分离到的PRV-XJ株在BHK-21细胞上生长滴度可达10~(7.67)TCID_(50)/mL,能被PRV阳性血清中和,其中和效价为1:128,将其接种小鼠,很快小鼠出现奇痒等神经症状,其对小鼠半数致死量为10~(3.32)TCID_(50)。本研究还设计了5对引物,用于gE、gC、gB和gD基因的PCR扩增和序列分析。结果显示所有序列均属于基因Ⅱ型,而所有欧美毒株则属于基因Ⅱ型,其中gE基因其他野毒株核苷酸同源性介于92.3%-99%,氨基酸序列同源性介于94.2%-98.4%,与其余几个具有代表性的毒株Fa、TJ和Ea株同源性分别为96.7%、98.1%、97.6%:PRV-XJ株gC基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为92.3%-100%和92.7%-100%,在50AA~102AA具有多个典型的特异性突变位点,与我国早期分离毒株Ea株、Fa株以及目前分离的PRV毒株GD、TJ、HND等均位于基因Ⅱ型,PRV基因Ⅱ型可以分为2.1和2.2两个亚群,2.1亚群包括我国早期分离毒株Fa株和马来西亚语2003年分离的3个毒株;2.2亚群则主要为我国1998至今分离的PRV流行毒株;PRV-XJ株gD基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为96%-100%和96.3%~99.3%,存在多个位点具有特征型的变异,和Ea株与基因Ⅰ型PRV比较在278AA~281AA有4个氨基酸(SPRP)的插入,而基因Ⅱ型在此位点则只有2个氨基酸(RP)的插入;gB蛋白较为保守,其主要的变异位点位于gB蛋白的53aa-55aa、70aa-102aa、121aa-124aa。本试验以PRV-XJ株为亲本毒株,利用PRV通用转移载体pPI-2-EGFP,通过同源重组,成功构建了双基因缺失病毒,通过对其进行PCR、间接免疫荧光(IFA)验证,结果显示,该基因缺失病毒正确缺失gI和gE基因,将其命名为rPRVXJ-delgl/gE-EGFP.通过蚀斑和无限稀释纯化方法,对其进行纯化,并绘制了其一步生长曲线,结果表明其与亲本毒株PRV-XJ株之间具有相类似的生长动力学,两组之间差异不显著。本试验还进行了基因缺失病毒rPRVXJ-delgl/gE-EGFP对仔猪安全性和免疫原性的探究,结果显示将rPRVXJ-del gl/gE-EGFP以同剂量不同免疫方式(滴鼻免疫和肌肉注射)和同免疫方式不同免疫剂量(10~5、10~6、10~8TCID_(50))接种仔猪后,免疫猪群未出现异常的临床症状,免疫后7天可以检测到gB特异性抗体,且滴鼻免疫和肌肉注射相比较差异不显著,免疫后7-28天gE抗体均为阴性,攻毒后可以保护免疫猪不发病,不表现出临床症状,但不能阻止野毒抗体转阳及排毒。这表明,该基因缺失病毒rPRVXJ-delgI/gE-EGFP对仔猪安全性好,能产生特异性抗体,可作为PRV基因缺失疫苗备选毒株。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S852.65

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