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《四川农业大学》 2016年
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鹅细小病毒结构蛋白真核表达质粒的构建及免疫原性初探

涂梦雨  
【摘要】:小鹅瘟是由鹅细小病毒(Goose parvovirus, GPV)引起的雏鹅急性败血性传染病。病鹅的临诊特点是精神委顿、食欲废绝、严重下痢、有时会出现神经症状。当前尚无治疗该病的特效药物,主要通过对开产前种鹅与雏鹅使用传统疫苗及高免血清进行预防。我国是全世界最大的水禽养殖国家,随着人民生活水平不断提高,对禽类肉蛋的需求不断增加,加上本病传播快、感染性强、致死率高、每年都有不同程度的流行,严重危害了养鹅业的发展,这要求我们应该深入了解该病毒的分子生物学特征及致病机制。本研究的主要内容有以下几点:1.将GPV的三个衣壳蛋白分别连接到真核表达载体上,构建出pcDNA3.1-VP1、 pcDNA3.1-VP2和pcDNA3.1-VP3重组质粒,以脂质体转染法将这三种质粒分别转染到哺乳动物细胞系和原代鹅胚成纤维细胞系(Goose embryo fibroblast, GEF),采用western blot的方法检测目的蛋白的表达情况。结果显示,重组VP1、VP2和VP3蛋白能分别与抗his标签抗体和抗GPV多抗血清在蛋白分子质量标准80 kDa、70 kDa和60 kDa附近发生特异性结合。说明这三种重组质粒能在同源及异源细胞中有效表达,为后续实验奠定了基础。2.利用GEF和鹅外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)为模型比较三种衣壳蛋白的细胞免疫原性。本研究将VPs的三种重组质粒转染GEF,60 h后收获细胞并提取总RNA,以实时荧光定量PCR (Real-time PCR,RT-PCR)的方法检测IL-6和IL-1β、FNs的转录水平。基于此,将GEF表达的VPs用于处理PBMCs,共孵育6 h,收集细胞抽提RNA检测CD4、CD8α、IL-6、IL-1β和IFNs的表达情况。还将GEF中表达的VP2经超离纯化、磷钨酸负染色后在透射电镜下观察。结果发现,VP2和VP3在GEF和PBMCs中都可显著上调IL-6和IL-1β的mRNA表达量。在PBMCs模型中,VP1诱导产生的细胞因子与实验对照相比无明显差异;而VP2还可显著上调IFNγ和IFNλ的量;VP3处理组的CD8α表达量显著高于VP1和VP2处理组。以上结果说明VP2和VP3的细胞免疫原性要优于VP1,且VP2在GEF中表达可形成病毒样颗粒。3.基于我们前期研究结果,VP2被挑选出作为DNA疫苗候选基因,再联合不同佐剂共同以肌肉途径免疫雏鹅,分别在免疫0d、7d、14d、21 d、28 d的时间点采集血液样品,采用RT-PCR和间接ELISA的方法分别检测被免疫雏鹅血液中CD4、 CD8α、IL-1β、IL-18、IFNs等细胞因子的转录水平变化,以及血清中特异性GPV IgY抗体水平,最后对几种免疫佐剂的免疫效果进行比较分析。结果显示,在免疫后的28 d内,CD4和CD8a的表达水平整体呈上升趋势;在免疫后第7d和第14 d,pcDNA3.1-VP2免疫组鹅血液中CD8a的表达水平显著上升;pcDNA3.1-VP2组也在第7d显著上调了IFNλ的表达;此外,pcDNA3.1-VP2与ODN2006佐剂联合免疫组分别在第7d和第21d显著上调了IL-1β和IL-18的表达。血清中特异性IgY抗体检测结果显示:除对照组外的三组实验组在免疫后14 d开始抗体增加,并随着时间增加而升高,至28 d时,抗体水平达到最高;pcDNA3.1-VP2、pcDNA3.1-VP2+MPLA、 pcDNA3.1-VP2+ODN2006免疫组的抗体水平均显著高于阴性对照组,但是不同佐剂组之间无差异。此外,在第21 d时pcDNA3.1-VP2免疫组的抗体水平显著高于阴性对照组。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S852.65

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