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《四川农业大学》 2016年
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林麝肺源致病性大肠杆菌部分耐药基因检测及crl毒力基因缺失株的构建

周鑫  
【摘要】:林麝肺炎和化脓性疾病是林麝规模化养殖中的主要疾病之一,无论发病率还是致死率都比较高,它一直以来都严重地阻碍着人工养麝业的可持续性发展。林麝肺源致病性大肠杆菌(Lung Pathogenic Escherichia coli,LPEC)是引起该病的重要病原菌之一。本文对实验室前期分离鉴定的29株林麝LPEC开展了以下研究:采用玻片凝集反应法进行了林麝LPEC的O血清型鉴定;采用PCR扩增方法检测了29株林麝LPEC包括磺胺类、喹诺酮类、β-内酰胺酶类、氨基糖苷类和四环素类共五大类抗生素的20种耐药基因;采用λ-Red同源重组方法构建了林麝LPEC O78菌株的crl毒力基因缺失株(LPEC O78-crl~-),并比较分析了野生菌株LPEC O78与缺失株LPEC O78-crl~-在生化特性、生长曲线、半数致死量(LD(_50))、病理组织切片以及红细胞凝集能力等方面的基本生物学特性差异。最终得到实验结果如下:1 林麝LPEC O血清型鉴定及部分耐药基因的PCR检测29株林麝LPEC中O血清型定型的有16株菌,分别属于9个不同的血清型,其中O78为主要血清型,占定型菌株的43.75%(7/16)。耐药基因的PCR检测结果显示:29株林麝LPEC皆携带多种耐药基因,20种耐药基因中共检测出15种耐药基因,其中磺胺类的sul 1、sul2和sul 3基因,喹诺酮类的aac (6’)-Ib和qnrB基因,β-内酰胺酶类的blaTEM和blaCTX-M基因,氨基糖苷类的aac(3)-lia ant(3)-la基因及四环素类的tet(B)基因具有较高检出率,分别为:100%、96.55%、96.55%、100%、86.21%、100%、65.52%、100%、96.55%和58.62%。UPGMA建树分析结果显示:O血清型与耐药基因的检测情况没有明显的相关性。2 林麝LPEC O78 crl毒力基因缺失株的构建及其生物学特性研究经PCR扩增测序鉴定,本实验所构建的crl毒力基因缺失株LPEC O78 crl~-中crl基因已被成功敲除。通过生化实验以及生长曲线的测定,证实crl毒力基因缺失不改变LPEC O78的基础代谢,对其生长速率影响不明显。半数致死量(LD_(50))测定结果显示:crl毒力基因缺失株LPEC O78-crl~-的LD_(50)为13.2×10~9CFU,野生株LPEC O78的LD_(50)为4.5×10~8CFU,与野生菌株LPEC O78相比crl毒力基因缺失株LPEC O78-crl~-毒力下降约7倍。观察野生株和crl毒力基因缺失株对小白鼠攻毒的病理切片可以看到,crl毒力基因缺失株对小白鼠实质器官的损害程度远小于野生菌株。另外,crl毒力基因缺失株LPEC O78-crl~-的细胞凝集效价为2~(-4),相比野生株LPEC O78的红细胞凝集效价2~(-5)有所减低,说明crl毒力基因的缺失对林麝LPEC O78的红细胞凝集能力有所降低。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S852.61

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