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《四川农业大学》 2016年
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稳定表达猪氨肽酶的HEK-293细胞系的构建与初步鉴定

卿盈  
【摘要】:猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起猪流行性腹泻(PED),给世界养猪业造成了巨大的经济损失。PEDV的细胞培养一直是该病研究的难点。病毒入侵机体被细胞表面受体识别。病毒受体是一类存在细胞膜或胞内的,能与病毒发生特异性结合进而激活一系列生理生化反应,使细胞对外界刺激产生相应的效应的特殊蛋白质。研究病毒受体能够更深层次的揭示病毒与宿主细胞的相互作用机制,从而为本病的防治提供更深入的科学依据。猪氨基肽酶(Porcine Aminopeptidase N,pAPN)是猪流行性腹泻病毒(PEDV)的猪靶细胞的功能性细胞受体。研究发现,将pAPN分子转入PEDV非允许ST细胞,该细胞过表达pAPN蛋白后能够使PEDV成功感染细胞并增殖复制。鉴于此,本研究从仔猪肠道克隆pAPN基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1-pAPN,将其转染到HEK-293细胞,通过G418加压筛选后,筛选稳定表达pAPN蛋白的HEK293-pAPN细胞系并进行了初步的鉴定。1. pAPN基因的克隆、真核表达质粒的构建及HEK293-pAPN细胞系的建立参照GenBank的猪APN mRNA参考序列(NM214277)设计一对引物Ps和Pa,以提取的仔猪小肠组织总RNA为模板,RT-PCR扩增出pAPN完整编码区cDNA序列,将其克隆至pMD19-T Simple载体,得到pMD-T-pAPN质粒。测序结果显示,扩增的pAPN基因含一个完整的阅读框,全长2892bp,编码963个氨基酸,该序列与GenBank中的参考序列同源性高达99.79%,没有碱基缺失,关键作用区域SPC段氨基酸序列同源性为99.93%,仅存在一个氨基酸突变。克隆pAPN片段,通过BamH I和Xho Ⅰ双酶切连接到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A上,构建真核表达质粒pcDNA3.1-pAPN,pAPN基因测序结果与pMD-T-pAPN中猪APN序列完全一致。将真核表达质粒pcDNA3.1-pAPN,转染至HEK-293细胞,通过G418筛选获得稳定表达猪APN蛋白的HEK-293细胞系。采用RT-PCR、间接免疫荧光试验和Western blot试验证实构建的HEK293-pAPN细胞系传代至20代能够稳定表达pAPN。2.PEDV感染HEK293-pAPN细胞系鉴定及其在HEK293-pAPN细胞和Vero细胞的增殖曲线比较PEDV SC-L株感染构建的HEK293-pAPN细胞,观察到的明显细胞病变主要表现为细胞变亮、皱缩、聚集,细胞中黑色颗粒样物质增加,随后细胞脱落、裂解。RT-PCR扩增得到PEDV特异性基因片段,间接免疫荧光试验和Western blot试验检测到病毒蛋白的表达,而未转染pcDNA3.1-pAPN的HEK-293细胞未检测出PEDV,证实PEDV能够感染构建的HEK293-pAPN细胞系,并在其内稳定增殖。用相同感染复数(MOI=0.1)的PEDV分别感染HEK293-pAPN细胞和Vero细胞,在感染的不同时间点收样,以实验室建立的PEDV ORF3基因的荧光定量PCR的方法和方程,扩增样品中的PEDV ORF3基因,并计算出拷贝数,绘制增殖曲线。PEDV SC-L株在两种细胞中的增值趋势非常相似,在病毒接种后80~100h处于裂解期,病毒大量增殖,在感染108h后趋于平稳期。病毒在Vero细胞中的滴度略高于HEK293-pAPN细胞中的增殖滴度,证实了构建的细胞系用于增殖PEDV的可靠性,从而为深入开展PEDV研究提供给了新的细胞工具。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S852.65

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