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《四川农业大学》 2016年
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PRRSV SC株GP5蛋白合成肽抗体的制备及ADE作用研究

黄剑波  
【摘要】:猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的猪繁殖障碍、呼吸道症状和高死亡率为特征的动物接触性传染病。由于PRRSV具有抗体依赖性增强作用(ADE),且易变异,因此在生产上难以预防。在PRRSV的蛋白结构上,GP5蛋白是PRRSV最主要的免疫原性蛋白,它能诱导机体产生中和抗体并具有最强的中和PRRSV的能力,也是引起ADE现象的主要原因,但在GP5蛋白上与ADE作用相关的抗原表位及其功能并不明确。本研究选用PRRSV SC株,进行了如下研究:1.PRRSV SC株GP5蛋白合成肽多克隆抗体的制备及鉴定运用DNAStar软件和IEDB在线进行PRRSV SC株GP5蛋白(GenBank:ABL60902.1) B细胞表位预测,选择位于GP5蛋白第36aa-48aa及145aa-156aa位的2个多肽序列(SC:SSHLQLIYNLTLC 及 LC:LLDTKGRLYRWR),并进行了人工合成,再与匙孔血蓝载体蛋白成功耦联,制成完全抗原。用耦联蛋白抗原SC和LC免疫雌性新西兰白兔,制备出的两种多抗SC和LC纯度均大于99%。经Western blot鉴定,合成肽耦联蛋白SC和LC分子量大小均约为90kDa,无非特异性条带,表明多克隆抗体SC和LC有良好的特异性和亲和性。琼脂扩散实验表明,多抗SC效价为1:16,多抗LC效价为1:8。2. PRRSV SC株GP5蛋白合成肽单克隆抗体的制备、筛选与鉴定用耦联蛋白抗原SC和LC分别对Balb/c雌性小鼠进行免疫,取三免后小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,成功筛选出2种阳性克隆杂交瘤细胞,即SC株和LC株。经间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,均出现绿色荧光信号。通过小鼠腹腔注射诱生腹水扩大生产并通过亲和纯化单抗,效价均达到1:12800。Western blot蛋白免疫印迹与抗体亚型鉴定表明,合成肽耦联蛋白SC和LC分子大小均约90kDa,无非特异性条带,表明单克隆抗体SC和LC具有良好的特异性和亲和性,2种单克隆抗体均属于IgG1亚型。3. PRRSV SC株对不同稀释度PRRSV高免血清的ADE作用研究通过对Genbank上公布的PRRSV ORF6基因序列,在其保守区设计了一对扩增引物,建立出荧光定量PCR标准曲线,标准曲线方程为:Y=-3.295X+35.766,并以此测定接种PRRSV SC株到Marc-145细胞中不同时间点的病毒拷贝数,并绘制出一步生长曲线,结果显示接毒后48-64h病毒拷贝数最高,为最佳收毒时间。将不同稀释度的高免血清与105.4TCID50PRRSV SC株混合感作1h后,分别加入Marc-145细胞孵育并培养64h,收集各组细胞液抽提RNA,并反转录进行荧光定量PCR。结果表明,各稀释度健康小鼠血清对PRRSV SC株的增殖没有影响,当高免血清稀释度1:1600时,病毒拷贝数随高免血清稀释度的增加而逐渐降低,说明高免血清对PRRSVSC株具有免疫性,产生了明显抑制作用,但高免血清在1:1600、1:3200两种稀释度时,两组细胞液的病毒拷贝数前者高于后者。与对应的各稀释度健康小鼠血清处理组相比,数据统计软件差异性分析结果表明,在1:100-1:1600稀释度时差异极显著,在1:3200时差异不显著。间接免疫荧光试验的验证结果与荧光定量PCR测定结果也基本相符,说明高免血清抗体稀释度于1:1600时,PRRSV SC株可能产生了ADE作用。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S852.651

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