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《四川农业大学》 2017年
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斑点叉尾鮰源海豚链球菌Srr蛋白海藻酸钠—壳聚糖口服疫苗的制备及免疫效果评价

王兴丽  
【摘要】:斑点叉尾鮰是我国主要鱼类养殖品种,近年来的大规模养殖使其养殖环境恶化,疾病频发,而海豚链球菌成为危害斑点叉尾鮰健康的致病菌之一。为了对斑点叉尾鮰海豚链球菌病进行防治,本研究以海豚链球菌Srr蛋白为抗原内芯,利用海藻酸钠-壳聚糖作为包被载体,通过乳化法制备海藻酸钠-壳聚糖-海豚链球菌Srr蛋白微球疫苗,并利用响应面法的Design-Expert8.0.6软件对微球疫苗的制备条件进行优化,然后将制备好的微球疫苗进行溶胀性能、酸碱性以及抗原性和安全性分析。最后利用制备好的微球疫苗口服免疫健康斑点叉尾鮰,对其相对免疫效果进行探究。通过本实验,拟对海藻酸钠-壳聚糖-Srr微球疫苗的制备以及基本性能进行初步探讨,并为斑点叉尾鮰海豚链球菌病的防治提供新的疫苗选择和免疫方式。本实验主要分为三个章节,主要内容如下:1、海藻酸钠-壳聚糖-Srr蛋白微球疫苗的制备以及工艺优化利用海豚链球菌Srr蛋白作为抗原内芯,以天然高分子聚合物海藻酸钠和壳聚糖作为包被载体,采用响应面法对海藻酸钠-壳聚糖-Srr蛋白微球疫苗的制备工艺进行优化,并利用优化的最佳条件制备Srr蛋白微球疫苗。首先通过单因素实验探究海藻酸钠浓度、水油相比例、氯化钙浓度以及壳聚糖浓度对微球疫苗包封率的影响,以单因素实验结果为依据,利用Design-Expert8.0.6软件中的Box-Behnken模式进行中心组合实验设计,采用4因素3水平的响应面法对海藻酸钠-壳聚糖微球疫苗的制备工艺进行优化。结果表明,各因素的最佳条件为:海藻酸钠浓度1.68%,水油相比例3.6:6.4,CaCl_2浓度9.64%,壳聚糖溶液浓度0.95%。通过获得的最优制备条件制得海藻酸钠-壳聚糖-Srr蛋白微球疫苗包封率为92.38%,载药率为19.41%,且粒径为4.26±1.13μm,适合鱼类口服疫苗的制备。2、海藻酸钠-壳聚糖-Srr蛋白微球疫苗的溶胀性能、体外释放研究、抗原性以及安全性研究利用响应面法优化的最佳制备工艺制备海藻酸钠-壳聚糖-Srr蛋白微球疫苗,以溶胀介质的pH、温度及离子强度对微球溶胀性能的影响以及微球在酸碱溶液中的蛋白释放情况来探讨微球的稳定性能,同时模拟胃肠道进行体外释放实验,并对其抗原的完整性和安全性进行检验。结果显示,对溶胀率检测3h发现,pH为2和7.4时该微球的溶胀性与微球稳定性无明显关系,最高溶胀率为1.15和1.24,但在碱性环境中时微球的溶胀性能较大,溶胀率为3.79,其稳定性变差,包被蛋白开始释放;随着温度以及离子强度的增加,微球的溶胀率也增加,16 ℃时溶胀率为0.41,28 ℃时为0.65,37 ℃为0.96;离子强度对溶胀率的影响更是显著,0mol/L时的溶胀率为1.63,0.3mol/L时为9.53,但在0.6mol/L时溶胀率为13.74;由此可见微球对溶胀介质的pH、温度以及离子强度都较为敏感。通过微球在酸碱性溶液中的蛋白释放情况可见其在酸性条件下较为稳定,在碱性条件下释放蛋白,且在模拟肠胃环境条件下也具有同样的释放情况,说明在药物和敏感成分的肠道靶向运输中具有广泛的应用潜力。通过Western-blot实验和安全性实验证实了包被蛋白抗原的完整性以及微球的安全性,以期为药物包被后的免疫效果及使用安全提供理论依据。3、海藻酸钠-壳聚糖-Srr蛋白微球疫苗的免疫效果评价为评价海藻酸钠-壳聚糖-Srr蛋白微球疫苗的免疫效果,实验以优化的最佳条件制备海豚链球菌Srr蛋白微球疫苗,口服免疫斑点叉尾鮰,测定免疫后第1-8周的血清抗体效价、总蛋白、溶菌酶、总超氧化物歧化酶及酸/碱磷酸酶活性等免疫指标,并于第4周使用海豚链球菌攻毒,最后采用荧光定量PCR检测口服疫苗对斑点叉尾鮰免疫相关基因转录的影响。结果表明,免疫后斑点叉尾鮰Srr微球组在第2周的血清中便能检测到抗体效价,且在第4周达到实验组的最高值0.99,一直到第8周也能检测到抗体效价,说明Srr蛋白微球疫苗能较长时间的产生抗体;Srr微球组的血清总蛋白、溶菌酶、总超氧化物歧化酶及酸/碱磷酸酶活性的指标中均极显著(P0.01)高于对照组;攻毒14d后Srr组和Srr微球组分别可获得抗海豚链球菌的相对免疫保护率为35%和60%。荧光定量PCR分析结果显示,在脾脏和头肾中Srr蛋白微球疫苗组的IFN-γ、TNF-α、MHC-Ⅱβ、CD4L-2的表达量都极显著高于对照组(P0.01),且明显高于其他实验组。研究表明,海豚链球菌Srr蛋白微球疫苗可有效增强斑点叉尾鮰免疫功能,能对斑点叉尾鮰海豚链球菌病起到较好的预防作用。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S948

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