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细粒棘球绦虫IAP、BIRP、ADK1、ADK8的原核表达及其功能初步研究

詹佳飞  
【摘要】:细粒棘球绦虫的中绦期幼虫—细粒棘球蚴能引起细粒棘球蚴病(又称为囊型包虫病),该病在世界范围内广泛分布,我国属高发地区之一,已严重威胁我国人类健康及畜牧业的发展。本研究在细粒棘球绦虫转录组数据库中筛选并原核表达了两个凋亡抑制蛋白家族基因(Eg-IAP、Eg-BIRP)和两个腺苷酸激酶家族基因(Eg-ADK1、Eg-ADK8),结合生物信息学方法对4个蛋白的分子特征进行了描述,并对重组蛋白进行了免疫印迹、免疫荧光定位的研究,同时利用相对荧光定量PCR(qRT-PCR)分析了4个基因在细粒棘球绦虫不同发育阶段的转录水平。此外,利用泛IAPs抑制剂-LCL161药物诱导体外培养的原头蚴发生凋亡,在光学显微镜及透射显微镜下观察原头蚴的形态变化,并利用Tunel法检测原头蚴的凋亡率,同时比较了两个基因在药物作用前后的转录水平差异。主要的研究结果如下:一、细粒棘球绦虫凋亡抑制蛋白基因(Eg-IAP、Eg-BIRP)的原核表达与功能研究凋亡抑制蛋白家族广泛存在于各类生物体内,对抑制细胞的凋亡有着举足轻重的作用。本研究克隆并原核表达了两个凋亡抑制蛋白基因(Eg-IAP、Eg-BIRP),其中Eg-IAP基因编码331个氨基酸,Eg-BIRP基因编码168个氨基酸。免疫印迹显示Eg-IAP和Eg-BIRP蛋白均能被绵羊细粒棘球蚴病阳性血清所识别,具有良好的反应原性。免疫荧光定位显示Eg-IAP和Eg-BIRP蛋白在原头蚴的表皮和顶突沟、可育囊的生发层及18日龄童虫的表皮和实质区上均广泛分布,但是在不育囊中免疫荧光十分微弱。qRT-PCR结果表明Eg-IAP和Eg-BIRP基因在原头蚴及18日龄童虫阶段均有转录,但在原头蚴阶段转录水平更高。此外,不同浓度的药物抑制剂-LCL161作用原头蚴8 h后,原头蚴均出现凋亡形态,且随着药物浓度的升高,原头蚴凋亡率逐渐上升。同时,两个基因的转录水平随着LCL161药物浓度的增加而逐渐下降。本研究结果表明这两个基因可能在细粒棘球绦虫抗凋亡的过程中有着不可替代的地位。二、细粒棘球绦虫腺苷酸激酶基因(Eg-ADK1、Eg-ADK8)的原核表达与功能研究腺苷酸激酶是一类广泛存在于生物体的磷酸转移酶家族,主要存在于耗能较高的组织中,在生物的生长发育中起着举足轻重的作用。本研究克隆并表达了两个腺苷酸激酶基因(Eg-ADK1、Eg-ADK8),其中Eg-ADK1基因编码197个氨基酸,Eg-ADK8基因编码344个氨基酸。免疫印迹显示Eg-ADK1和Eg-ADK8蛋白均可被绵羊细粒棘球蚴病阳性血清所识别,具有良好的反应原性。免疫荧光定位显示Eg-ADK1和Eg-ADK8蛋白在原头蚴的表皮和顶突沟、可育囊及不育囊的生发层以及18日龄童虫的表皮和实质区上均广泛分布。qRT-PCR结果显示Eg-ADK1和Eg-ADK8基因在原头蚴及18日龄童虫阶段的转录水平无明显差异。研究结果表明Eg-ADK1和Eg-ADK8在细粒棘球绦虫的生长发育过程中发挥了重要作用。


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