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《四川农业大学》 2018年
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宿主miR-499-5p靶向流行性乙型脑炎病毒NS2A基因抑制病毒增殖及对NF-κB通路调控作用的研究

吕雯婷  
【摘要】:JEV是一种具有严重危害的人畜共患嗜神经性病毒,能够导致人类死亡或永久性神经系统后遗症,对人类影响巨大。此外,猪作为JEV的储存及扩增宿主,JEV感染给养猪业也带来巨大损失。JEV的生态学复杂,普遍认为需以蚊虫为媒介才能进行个体间的传播,可是最近有研究表明,猪之间仅通过直接接触就可进行传播,且口鼻部高度易感。当下针对除疫苗接种和灭蚊外,无特异性药物或治疗方法的JEV感染,其防控更加艰难,对JEV的防治研究有着重要的实际应用意义。miRNA作为一种在转录后水平发挥基因调控功能的非编码小分子RNA,参与到细胞生长、分化、凋亡和代谢等生命过程,并且在病毒感染入侵及宿主细胞的抗病毒方面起着重要的调节作用。本试验选取已初步鉴定为对JEV复制具有较强抑制作用且暂无调控病毒感染机制相关报道的miR-499-5p为研究对象,首先对JEV SC-2株进行增殖培养及TCID_(50)测定,建立JEV qRT-PCR检测方法,测定JEV SC-2株在2种细胞中的增殖规律。通过转染miRNA模拟物mimics以及抑制剂inhibitor实现miR-499-5p过表达或表达抑制,并利用qRT-PCR及TCID_(50)方法验证miR-499-5p对JEV的调控作用。结果显示,JEV SC-2株感染BHK-21细胞的TCID_(50)=10~(-5.68)/100μL,感染PK-15细胞的TCID_(50)=10~(-5.46)/100μL,且JEV SC-2株感染BHK-21细胞12 h后开始进入对数生长期,而接种PK-15细胞在24 h后才进入对数生长期。试验还证明miR-499-5p的过表达显著抑制JEV基因水平表达,而抑制miR-499-5p的表达则导致JEV基因水平的明显上升;且miR-499-5p的过表达还将导致JEV病毒滴度的降低,表明miR-499-5p能抑制JEV的病毒增殖。为探究JEV被miR-499-5p调控的原因,首先通过靶标预测软件对miR-499-5p靶向JEV基因组的潜在靶标位点进行预测,成功构建其潜在靶标位点的野生型及突变型双荧光素酶报告基因重组质粒,利用双荧光素酶报告基因检测系统进行检测,结果发现miR-499-5p可使野生型重组质粒pEZX-NS2A-WT的相对荧光素酶活性显著下调,而对突变型重组质粒pEZX-NS2A-mut无明显影响,进一步采用竞争抑制的方法,JEV感染能竞争性的结合或消耗转染入细胞的miR-499-5p,从而间接消弱其对pEZX-NS2A-WT荧光素酶活性的抑制作用,更加确定miR-499-5p可以靶向JEV基因组RNA来抑制其复制。为进一步探究miR-499-5p与JEV的关系,利用生物信息学分析方法,对miR-499-5p的潜在靶标基因进行了富集分析,并结合已发表研究,从炎症通路NF-κB通路、细胞凋亡通路入手,过表达miR-499-5p,采用相对荧光定量PCR检测两条通路中的重要节点NF-κB1(p50)、ReL-A(p65)、Bcl-XL、Mcl-1、PUMA的基因水平差异,结果显示miR-499-5p种间高度保守,且参与许多细胞生物学过程,能从基因及蛋白水平抑制p50的表达,且能显著抑制由JEV引起的炎症因子IL-6、IL-8的上调。研究表明miR-499-5p有作为JEV潜在防控靶标可能,为JEV的防控提供了新思路,该研究结果也丰富了miRNA与病毒相互作用的理论基础。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S852.65

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