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《四川农业大学》 2001年
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黑曲霉N25植酸酶phyA基因表达片段的克隆及pPIC9K重组酵母表达载体的构建

马孟根  
【摘要】: 采用改良二次沉淀法从黑曲霉N25中抽提出细胞总DNA。根据本课 题组已经测定出的,并在GenBank中注册的黑曲霉N25植酸酶phyA基 因的全序列(Accession No. AF218813),从信号肽序列切割位点序列之 后(第19个氨基酸之后)设计上游引物(设计一个EcoRI酶切位点); 在终止密码子处设计下游引物(设计两个酶切位点KpnⅠ和NotⅠ)。用高 保真度的聚合酶Advantage-HF PCR Kit进行表达片段扩增,通过对PCR 条件的优化,得到了大小约1.4kb的单一条带产物。将该产物经EcoRⅠ 和KpnⅠ酶切处理后连接到pUC18载体上,转化大肠杆菌JM109菌株, 在含Amp和x-gal的LB平板上筛选到了白色的阳性菌落。质粒酶切分 析结果表明获得了pUC18-phyA重组质粒(命名为pANP-1);测序结果 表明,表达片段除不含有信号肽和内含子外,其序列与黑曲霉N25植酸 酶phyA基因相对应的序列完全一致。采用EcoRⅠ和NotⅠ内切酶从pANP-1 质粒中酶切出phyA基因表达片段,插入到毕赤巴斯德表达载体pPIC9K 的多克隆位点,并转化大肠杆菌DH5a菌株,用光生物素标记的phyA基 因探针进行原位杂交,筛选到了阳性转化菌落,质粒酶切分析结果表明 获得了pPIC9K—phyA重组表达载体,命名为pPNP-1。pPNP-1重组表 达载体的构建为phyA基因在毕赤巴斯德酵母中的高效表达奠定了基础。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:S816.79

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 韩笑;黑曲霉β-葡萄糖苷酶的基因克隆与表达研究[D];中南林业科技大学;2008年
【参考文献】
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【共引文献】
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10 占志勇;不同地理种源鹅掌楸的ISSR遗传分析[D];中南林业科技大学;2010年
【同被引文献】
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【二级引证文献】
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【二级参考文献】
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3 赵述淼;烟熏曲霉植酸酶基因phyA的克隆及其在毕赤酵母中的表达[D];华中农业大学;2004年
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