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《四川农业大学》 2002年
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植酸酶phyA基因转化毕赤酵母的筛选及工程菌培养基研究

王平章  
【摘要】: 本研究以本课题组构建的植酸酶phyA基因表达载体pPIC9K-PhyA为材料,采用电击转化法将phyA基因导入毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)。通过对电击转化条件的筛选,结果表明选择Bio-Rad电穿孔仪的转化条件以2.0kv,1个脉冲较好,其转化效率比相关报道的采用BTX电穿孔仪在参数为1.0kv,50uF,200R时的转化效率更高。本研究共筛选出重组转化子15株,其在MD平板生长迅速,在删平板上生长缓慢,甲醇利用型为Nut~s。经酶活测定,15株重组转化子均可产生植酸酶,其中转化子PP-NP-5菌株采用BMGY培养基进行细胞增殖,采用BMMY培养基进行诱导产酶,36h后酶活达到52041u/ml,其活性是出发菌株(黑曲霉A.niger25)酶活(513.4u/ml)的101倍,比本课题组王红宁等报道的69.4倍提高了45%,比国内姚斌等报道的15000u/ml高了2.47倍,比国外Yanming Han报道的KM71重组子的酶活26000u/ml高了1.00倍,实现了phyA基因的高效分泌性表达。 本研究对基因工程菌PP-NP-5进行了DNA水平的鉴定。斑点杂交试验结果表明phyA基因导入了巴斯德毕赤酵母基因组,并用PCR法扩增出长约1.6kb的DNA片段,与phyA基因大小相符合。Southern blotting分析表明,phyA基因以双交换方式单拷贝整合到了酵母染色体DNA。 本研究在国内外首次以麦芽为原料,对毕赤巴斯德基因工程菌培养基进行了研究。采用料水比为1:6的麦芽汁培养基对工程菌PP-NP-5进行细胞增殖培养,用料水比为1:6的麦芽高温浸提培养基进行诱导产酶培养,浓缩细胞和不浓缩细胞时,酶活分别达到22598u/ml、12720u/ml,并且产酶活性稳定。在其他培养条件相同的情况下,本研究筛选的培养基成本与酶产量比价分别为0.009866元/100000u(细胞不浓缩)、0.03005元/100000u(细胞浓缩),而购买的BMGY和BMMY培养基成本与产酶量的比价为1.97104元/100000u。结果表明:采用本研究制备的麦芽汁培养基(生长培养基)和麦芽高温浸提培养基(产酶培养基),当细胞浓缩与不浓缩时,培养基成本分别降低了198.78倍和64.59倍。经济效益即产出与投入之比分别是合成培养基(BMGY、BMMY)的200倍和66倍,有效的降低了成本,为基因工程菌的扩大生产奠定了基础。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:Q939.9

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【引证文献】
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1 焦龙;毕赤酵母工程菌pk53产纤溶酶发酵的优化研究[D];河北农业大学;2011年
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【参考文献】
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【共引文献】
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9 吴崇晖;庞全海;;一株酒香酵母菌的初步鉴定及对小鼠非特异性免疫功能的研究[A];中国畜牧兽医学会——第三届中国兽医临床大会论文集[C];2012年
10 郭玉平;郭显;周佳佳;桂丽娟;孙觅真;袁延超;邢会贤;伊海法;王丽媛;宋宪亮;孙学振;;不同棉种同义密码子偏爱性分析[A];山东省棉花学会第六次代表大会暨学术讨论会论文汇编[C];2013年
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2 张曈;海洋季也蒙毕赤酵母重组菊粉酶及其在产乙醇中的应用[D];中国海洋大学;2010年
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8 董晓鹏;内皮抑素在肺腺癌中的表达及其对小鼠Lewis肺癌淋巴管生成和淋巴转移的影响[D];山东大学;2011年
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10 赵鹏伟;蒙古绵羊β-防御素-1的表达、纯化及生物学功能研究[D];内蒙古农业大学;2011年
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1 于宾宾;表达猪β-防御素-2成熟肽重组酵母工程菌的构建[D];华中农业大学;2010年
2 郭俊红;利用原生质体融合及基因工程的方法对柑橘采后生防菌34-9遗传改良的初步研究[D];华中农业大学;2010年
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6 王志强;内切葡聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母GS115中的表达[D];郑州大学;2010年
7 仲伟磊;引入新的二硫键对植酸酶结构和功能的影响[D];山东农业大学;2010年
8 康雪燕;猪传染性胃肠炎病毒S蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及免疫原性分析[D];山东农业大学;2010年
9 王希辉;鸡白介素18成熟蛋白突变体在毕赤酵母中的高效表达及其生物活性检测[D];山东农业大学;2010年
10 林雪;蛋白A的重组表达及重组菌的发酵过程优化[D];大连理工大学;2010年
【同被引文献】
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【二级引证文献】
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