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《四川农业大学》 2004年
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乌骨鸡肝脏差异显示(DD)表达序列标签(ESTs)的筛选及分析鉴定

李亮  
【摘要】:乌骨鸡是我国独特的家禽品种,丝羽乌骨鸡更以其特有的外貌特征而名列国际标准品种之一,国内长期以来都将乌骨鸡视为药用品种。基因及表达的差异是导致生物性状多样性的根本原因,乌骨鸡与其他鸡种相比所表现的各种独特性状必定也是由于基因及其表达的差异所引起。目前,差异显示逆转录聚合酶链式反应(DDRT-PCR)技术已经成为筛选差异表达基因的有效手段之一,在生物学领域中的应用范围不断扩大。本试验应用DDRT-PCR技术研究乌骨鸡与普通蛋鸡及肉鸡在成年阶段肝脏组织中基因表达的差异,筛选乌骨鸡差异表达的表达序列标签(ESTs),将所得ESTs与现有核酸序列数据库进行比对,找到与乌骨鸡特异性状表达的相关基因或者作为新的ESTs添加到现有核酸序列数据库,并通过电子延伸和电子定位等方法对乌骨鸡差异表达基因进行分析。 本试验成功地从丝羽乌骨鸡(SK)、常羽乌骨鸡(NP)、苏禽96型蛋鸡(SQ)以及爱拔益加肉鸡(AA)的成年鸡肝脏组织中提取到质量较高的总RNA,首次采用DDRT-PCR技术对四个家鸡品种肝脏中差异表达的基因进行了研究。试验采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染方法分离差异片段,利用单链构象多态性(SSCP)技术验证差异显示片段的重扩增产物成分的单一性,采用反向Northern斑点杂交和Northern斑点杂交技术相结合对获得的乌骨鸡差异显示cDNA片段进行差异真实性的鉴定。经过克隆测序,试验最终得到10条乌骨鸡差异表达的表达序列标签。将序列提交到Genbank中的dbEST数据库,分别获得登录号(CN606328~42N606329、CN606331~CN606338)。 将乌骨鸡差异显示的ESTs通过BLASTn工具对Genbank的nr数据库和dbEST数据库中所有家鸡(Gallus gallus)的核酸序列进行相似性搜索,发现所获得的10条乌骨鸡差异表达的EST中,有3条EST序列(CN606332、CN606333、CN606336)与家鸡2个已知基因具有很高的相似性,可认为是这2个已知基因的同源序列。其余7条EST序列中,有3条(CN606328、CN606331、CN606338)与家鸡已有核酸数据库中的cDNA克隆或EST具有较高相似性,可认为是家鸡已知EST,但功能未知;另外4条EST序列(CN606329、CN606334、CN606335、CN606337)在家鸡已有核酸数据库中未找到同源已知基因和EST,认为是家鸡 四川农业大学博.士论文 的新ESTs。 与已知基因同源的乌骨鸡差异表达ESTs中,CN606332和CN606336与家鸡 的185 rRNA基因同源,差异显示片段CN606333与编码家鸡热休克蛋白70的 基因(月叹只4J)同源。根据反向Northern杂交和Northem杂交的结果,CN606332 仅在丝羽乌骨鸡中表达,CN606336和CN606333仅在丝羽乌骨鸡和常羽乌骨鸡 中表达,表明与它们同源的2个基因的在成年乌骨鸡与普通鸡种(蛋鸡和快大型 肉鸡)的肝脏中的表达情况有差异。对两个基因分别利用BLASTh对家鸡基因 组数据库(Chicken wgs--contig)进行检索,发现家鸡的1 85核糖体rRNA基因 在4、6、14和26号染色体上都有分布,家鸡产不夕剐J基因位于17号染色体上。 对三条与家鸡核酸序列同源但功能未知的EST序列(CN606328、CN606331、 CN606338),分别利用电子延伸的方法寻找与它们同源的cDNA序列,各自获得 长度为556bp、1276bp的两个重叠群(contigs)序列和一个长1374bP的开放阅 读框(O盯)。对三条cDNA序列进行的功能分析表明,与CN606328同源的556bP cDNA片段所编码的151个氨基酸与人类、大鼠、小鼠等物种的核糖体蛋白513 的氨基酸序列完全一致,表明该序列是鸡的核糖体蛋白513的cDNA序列,我 们将其命名为c尺尸513(ehieken ribosomal protein 513)并提交到GenBank数据库, 登录号为(AY626809)。通过与家鸡基因组数据库的比较,我们发现基因cRPS13 位于家鸡的5号染色体上。分析与CN606331同源的1276bp的contigs序列,发 现该序列的正向第二阅读框(Frame=十2)翻译得到的蛋白质序列(1 40个氨基 酸)与人、大鼠、小鼠核糖体蛋白L19的196个氨基酸中的140个氨基酸上仅有 一个氨基酸的变异,表明该序列为鸡的核糖体蛋白L19基因的一部分。根据与基 因组数据库的比较结果,我们认为鸡的核糖体蛋白L19基因位于27号染色体上。 对CN606338进行电子延伸的结果表明,它属于一个长为1374bp的开放阅读框 (ORF),根据该ORF翻译得到的蛋白质序列与恒河猴(Macaca mulatta)及其 他生物的异常纺锤型小脑畸形症(abnormal sPindle mierocePhaiy,ASpM)蛋白 有一定的相似性,表明该O舒有可能是家鸡ASPM基因序列的一部分,但根据 现有数据,尚不能得到家鸡ASPM基因的全序列。 对于4条新EST序列(CN606329、CN606334、CN606335、CN606337), 分别通过BLASTx和TBLASTx工具对nr数据库中所有蛋白质序列进行了相似 乌骨鸡肝脏差异显示(DD)表达序列标签(E sTs)的筛选及分析鉴定 性搜索,结果表明CN606329可能与一种细胞膜蛋白基因同源,CN606334可能 与Y一谷氨酞转肤酶(gamma一glutamyl transpeptidase)基因同源,eN606335可能与 ATp一binding cassette transporter基因同源,而eN606337与人的假设蛋白 (hyPothetieal Protein)MGC27019有一定的相似性。对这几个EST进行基因组 序列的比较,发现CN606329、CN606335、CN606337
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S831.2

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