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《四川农业大学》 2004年
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基因突变技术提高phyA植酸酶在毕赤酵母中表达量及热稳定性的研究

陈惠  
【摘要】:植酸酶作为单胃动物的饲料添加剂,其使用效果已在世界范围内得到了确证。但是,目前植酸酶在饲料中的推广和应用还相当有限,主要原因在于:(1)植酸酶基因工程菌的产酶量有待进一步提高;(2)植酸酶的热稳定性欠佳不能完全满足饲料加工、贮藏的要求。目前,蛋白质工程技术已成为修饰和改造天然酶的有效手段,为植酸酶产量的提高和热稳定性的改善开辟了新的途径。本研究在对本课题组已注册的植酸酶phyA基因核苷酸序列及氨基酸序列分析的基础上,通过对phyA基因进行同义突变、定点突变以及结构延伸突变,获得在毕赤酵母中高效表达并且热稳定性良好的植酸酶,其结果主要如下: 1、对来源于本课题组自主分离的黑曲霉N25(Aspergillus niger China Strain)的植酸酶基因phyA(GenBank:基因注册号为AF218813,蛋白质序列号为AAF25481)进行PCR介导的定点突变。在不改变其所编码氨基酸条件下,选用毕赤酵母偏爱的密码子对该基因保守序列中第81位和第85位的Arg密码子进行同义突变,构建了含正确突变的酵母表达载体pPIC9k-phyA~m。电击转化毕赤酵母GS115,经筛选培养基MM、MD平板筛选和产物的酶活性测定,筛选出突变的高酶活酵母转化子2株。这2株转化子的Southern blotting结果显示突变基因phyA~m以单交换方式单拷贝整合到酵母染色体DNA中;表达产物的SDS-PAGE分析表明,重组酵母中的植酸酶能有效分泌和表达,其酶蛋白分子大小为70.15kD;转化子酶活测定结果可知,经密码子优化的突变重组酵母的酶活力明显高于未进行优化的重组酵母转化子。密码子优化后的突变重组酵母株PP-NP~m-8于麦芽汁培养基中诱导36h后,酶活力可达47600 U·ml~(-1),比未优化重组酵母株PP-NP-2(23667 U·ml~(-1))提高了1.01倍,经十代传代实验汪实重组转化子遗传稳定性良好。 2、采用反向长距离PCR技术对上述重组酵母PP-NP~m-8的植酸酶突变基因phyA~m进行PCR介导的定点突变,即将植酸酶43位的苯丙氨酸替换为酪氨酸(F43Y),将其354,358位的异亮氨酸、亮氨酸分别替换为甲硫氨酸和苯丙氨酸(1354M,L358F),得到了两个突变体PP-NP~(m-1)(F43Y)及PP-NP~(m-2)(I354M,L358F)。含突变基因的重组表达载体pPIC9k-phyA~(m-1),pPIC9k-phyA~(m-2)在毕赤酵母GS115中表达,对表达产物
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S816.7

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