伪狂犬病病毒、猪细小病毒和流行性乙型脑炎病毒检测基因芯片的构建及检测技术研究

【摘要】：本研究首次构建了PRV-PPV-JEV检测基因芯片,建立了PRV、PPV和JEV基因芯片检测新技术,该基因芯片技术对PRV、PPV和JEV具有同步检测和鉴别诊断,同时对PRV的野毒株和基因缺失疫苗株也具有鉴别功能。主要内容为以下几个部分: 1.PRV-PPV-JEV检测基因芯片靶基因克隆及鉴定 对PRV、PPV和JEV进行病原分子生物学分析,参考GenBank和文献中报道的PRV、PPV和JEV基因序列,采用Array Designer2.0软件分别设计了PRV、PPV和JEV靶基因引物。采用PCR或RT-PCR扩增靶基因扩增获得16个靶基因片段,用pMD18-T克隆和筛选获得了T/gB、T/gG、T/TK、T/gE、T/B1 NS1、T/B1 VP2、T/SR-1 NS1、T/SR-1 NS2、T/SR-1 NS3、T/SR-1 VP1、T/SR-1 VP2、T/C、T/PrM/M、T/E、T/NS1、T/NS5靶基因重组质粒。经序列测定和对位排列分析,结果为gB、gG、gE、TK靶基因扩增自PRV Fa株,分别为PRV gB、gG、gE、TK基因片段,片段长度分别为324bp、261bp、148bp、177bp;PPV靶基因B1 NS1、B1 VP2扩增自PPV B1株,SR-1 NS1、SR-1 NS2、SR-1 NS3、SR-1 VP1、SR-1 VP2扩增自PPV SR-1株,片段大小分别为127bp、471bp、208bp、550bp、389bp、209bp、471bp;JEV C、PrM/M、E、NS1和NS5靶基因扩增自JEV SA14-14-2株,分别为JEV C、PrM/M、E、NS1和NS5基因片段,片段长度分别为238bp、451bp、439bp、476bp和448bp。多重序列比对和BLASTN分析进一步表明:克隆鉴定的靶基因为目标病原的高度保守性基因,为PRV-PPV-JEV检测基因芯片的构建提供了确实可靠的材料。 2.PRV-PPV-JEV检测基因芯片的构建 本试验研究了PRV-PPV-JEV检测基因芯片靶基因和探针制备方法、靶基因杂交温度和特异性,确定了构建诊断芯片的靶基因及其浓度和有关芯片质量控制方法,结果如下。 1) 靶基因和定位对照基因的制备 以靶基因重组质粒DNA为模板,采用PCR扩增、异丙醇沉淀法纯化靶基因,其浓度和纯度符合芯片制作要求,定位对照基因制备参照曹三杰(2004)报道方法进行。 2) 探针的制备 以病毒DNA、cDNA和λDNA为模板,PCR扩增标记荧光素Cy3制备探针,Cy3-dCTP的使用终浓度为2.5 μmol/L,制备的探针浓度在121-748ng/μL之间。 3) 本试验确定了靶基因最适点样浓度为200ng/μL,芯片系统灵敏度为3pg/μL探针,筛选出杂交信号强、杂交特异性好的靶基因及其杂交温度,确定了PRV-PPV-JEV检测基因芯片的预杂交时间为1h和杂交时间为6h。 4) 数据分析采用QuantArray~(?) Ver.3.0软件,数据量化使用总信号强度模式和信号中位值模式,总信号模式输出的样点信号强度与背景之比为SNR。 5) 基因芯片制备和质量控制 研究确定PRV gB、PRV gG、PRV TK、PRV gE、PPV B1 VP2、PPV SR-1 NS2、PPV SR-1 NS3、PPV SR-1 VP1、JEV C、JEV PrM/M、JEV E、