猪繁殖与呼吸道综合征、猪瘟和猪圆环病毒病诊断DNA微阵列的构建及其检测技术研究

【摘要】：本研究首次应用DNA微阵列技术构建了猪繁殖与呼吸疾病综合症病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪圆环病毒2型(PCV2)检测芯片,建立了PRRS、CSF和PCV2感染基因芯片检测新技术,主要研究内容包括下面三个方面。 1.靶基因克隆、鉴定与分析 对GenBank中报道的PRRSV、CSFV和PCV基因序列进行多重序列对位排列分析(MSA),应用ArrayDesigner2.0软件针对保守区域设计靶基因。PRRSV和CSFV采用RT-PCR一步法、PCV采用PCR法扩增共获得了15个靶基因片段,用pMD18-T克隆、筛选获得T/PRRS-PS9、T/U1b、T/E6、T/E8、T/C14P9、T/Y11、T/Y12、T/CSFPS5、T/CSF1、T/Npro、T/Erns、T/HCLVP7、T/PCVCQB7、T/PCV2P6和T/PCVT3等15个靶基因重组质粒,经序列测定、MSA分析结果为: 1) PRRS-PS9(基因收录号:AY775134)、U1b(基因收录号:AY775135)、Y11(基因收录号:AY775133)、Y12(基因收录号:AY775136)和C14P9(基因收录号:AY775132)扩增自PRRSV C14-2,分别为PRRSV美洲型5’UTR、ORF1b、ORF6、ORF7、ORF5基因片段,片段大小分别为174bp、301bp、155bp、176bp、468bp;E6和E8扩增自西班牙PRRS疫苗株VP046,为PRRSV欧洲型ORF6和5’UTR基因片段,长度分别为350 bp和191bp。PRRS靶基因与同型毒株的核苷酸序列一致性在90%以上,个别基因高达100%,与异型毒株则在70%以下,其中C14P9靶基因与国外VR2332参考毒株和主要美洲型弱毒疫苗株的核苷酸序列一致性高达99%左右,而与国内多数分离株的序列一致性在85%左右。 2) 靶基因CSFPS5(基因收录号:AY775139)、CSF1(基因收录号:AY775140)、Npro(基因收录号:AY775138)、Erns(基因收录号:AY775137)扩增自猪瘟临床病料、HCLVP7(基因收录号:AY775141)扩增自猪瘟兔化弱毒疫苗,分别为CSFV 3’UTR、5’UTR、N~(pro)、E~(rns)和E2基因片段,长度分别为133 bp、143 bp、293 bp、301 bp和490bp。MSA分析发现CSF靶基因与瘟疫病毒属1、2、3、4型和待定的5型和6型核苷酸序列一致性分别为:CSFPS5,30-50%、80-100%、40-60%、40-50%、48%、48%;CSF1,60-70%、95%、80%、64%、68.71%、68.54%;Npro,70-75%、85-100%、75%、35-40%、77%;Erns,55-60%、80-100%、30-35%、50-55%、55.94%、57.96%:HCLVP7,60-65%、90%、40%、60-65%、64.51%、66.55%。