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《四川农业大学》 2006年
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猪繁殖与呼吸综合征病毒MN基因的原核表达探索及M-ELISA诊断方法的建立

赖维莉  
【摘要】:猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是近年来发现的一种新病毒,引起猪的繁殖和呼吸系统综合征。该病以母猪发热、厌食和流产、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征。PRRSV是目前养猪业中一种严重的病毒性传染病,本病自九十年代中期在我国发现以来,现已在全国呈蔓延趋势,所以对PRRSV的检测及预防尤为重要,建立一种快速高效的诊断方法对于PPRSV的控制具有重大的意义。 用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ对重组质粒pMD18-T-MN进行双酶切,回收获取MN基因片段后将其亚克隆至pBV220原核表达载体上;重组表达质粒用Pvu Ⅱ进行单酶切鉴定,EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ进行双酶切鉴定;经酶切初步鉴定后,送宝生物工程(大连)有限公司测序,将其序列与pMD18-T-MN上MN基因序列进行比对,未发生碱基突变。由此可知,本试验成功构建了重组表达质粒pBV MN。将重组表达质粒pBV MN转化宿主菌DH5α,重组表达质粒菌经30℃活化过夜后,1∶50稀释到LB培养基增殖培养,待浓度达到OD_(600)=0.2~0.4时,迅速升温至42℃诱导4~6h,收集细菌,裂解后经SDS-PAGE可检测到一条分子量约为19kd的目的蛋白条带,经蛋白质分析软件Bandscan分析,其表达量可达19.1%;Western-Blotting分析结果表明该重组蛋白可被兔抗PRRSV血清所识别,与预期的M基因表达产物相一致,而N基因的表达产物未检测到。将重组表达质粒菌进行温度敏感诱导表达,之后对表达的重组M蛋白进行纯化用作包被抗原,建立了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA方法,并确立了ELISA最佳工作条件:抗原包被浓度为3.5μg/ml,37℃ 1h,4℃过夜,血清(1∶40)和酶标SPA(1∶80)分别在37℃温育1h,加底物溶液常温显色5分钟后观察结果。经重复性试验、交叉试验、阻断试验等试验,结果表明该方法重复性好、特异性强、敏感度高;将建立的M-ELISA方法与美国IDEXX公司PRRSV抗体检测试剂盒相比较,其特异性和敏感性分别为96.3%和93.5%,符合率达到89%,统计学分析,这两种检测方法的检测结果无显著性差异。用M-ELISA操作程序对来自四川地区不同猪场的168份样品进行检测,结果表明,四川各地不同猪场的血清样品均有不同程度的PRRS抗体,各猪场的PRRS污染率在5.9%~67.6%之间,平均阳性率为39.9%。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:S854.43;S858.28

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【参考文献】
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