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鸭疫里默氏杆菌荚膜多糖输出蛋白基因的发现及其免疫原性研究

朱德康  
【摘要】:鸭疫里默氏杆菌病是家鸭、火鸡和多种其它鸟类的一种接触传染性疾病。该病呈世界范围分布,已在几乎所有的集约化养鸭生产的国家发现。该病的发病率和死亡率较高,已成为目前危害世界各国养鸭业最为严重的传染病之一,给养鸭业造成了巨大的经济损失。到目前为止,关于鸭疫里默氏杆菌的分子生物学研究资料较少,国内外尚无关于血清1型RA基因文库的研究报告。由于目前我国鸭疫里默氏杆菌病流行的血清型以1型出现频率最高,因此我们以血清1型RA菌株为材料构建基因文库,以期筛选出相应的抗原基因,为RA基因工程疫苗研究奠定基础,为该病的诊断与流行病学监测提供高纯度的特异性抗原。 本研究以血清1型RA CH-1株为材料,酚氯仿抽提基因组DNA。采用限制性内切酶Sau3A Ⅰ进行部分酶切消化,首先小量酶切优化确定酶切时间和作用浓度,然后在小量酶切预试验基础上扩大反应体系进行酶切,采用试剂盒纯化回收1.0kb-6.5kb片段,将其用T4 DNA连接酶与经BamH Ⅰ酶切并去磷酸化的ZAP Express载体进行连接,用噬菌体包装蛋白包装。经测定包装滴度为5.23×10~6pfu/ml,蓝白斑筛选重组率为96.8%,表明已成功构建血清1型RA基因文库。 在成功构建RA基因文库的基础上,采用兔血清对文库进行免疫筛选,获得了3个阳性斑,并对其中一个进行了复筛及纯化,对该阳性斑进行体内删除,对获得含插入片段的噬菌粒进行酶切鉴定正确后进行测序,并将该序列递交GenBank,获得登录号为DQ151838。 通过核酸序列相似性搜索比对、ORF分析、基因预测,初步判定ORF1110读框是一个完整的有意义ORF,是与荚膜多糖蛋白相关的基因;ORF1155读框则与外膜蛋白相关,但起始密码子上游未发现RBS(可能与起始密码子上游序列长度太短有关),因此无法判断是否是一个真正的ORF;而ORF2141读框囿于序列长度只有起始密码子而没有终止密码子,因此并不是一个完整的ORF,有必要通过试验来补齐这段序列再进行分析;通过蛋白质序列搜索比对、亚细胞定位、跨膜区、疏水性预测分析,进一步证实ORF1110与荚膜多糖生物合成密切相关,而ORF1155则与包括外膜蛋白、表面抗原的多个蛋白家族相关;采用软件进行抗原性预测分析表明ORF1110


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