鹅细小病毒VP3基因与鹅白细胞介素-2基因分泌性融合表达载体的构建及在乳酸杆菌中表达的研究

【摘要】： 随着养殖业向集约化和管理向人性化发展，口服疫苗逐渐成为研究的热点和重点，乳酸杆菌是肠道正常的益生菌，具有天然的抗菌、抗病毒和抗肿瘤的作用。利用基因工程手段，将乳酸杆菌开发成为具有特定功能的基因工程菌，使其在肠道分泌抗原蛋白以达到免疫的目的。本研究以较为保守的鹅细小病毒(Goose Parvovirus，GPV)VP3基因为抗原基因，同时为了更好地提高免疫效果，将鹅白细胞介素-2(Intedeukin-2，IL-2)成熟蛋白基因IL2c与VP3基因融合，并使其在乳酸杆菌中得到良好表达，为研制鹅IL-2增强鹅细小病毒VP3乳酸杆菌口服基因工程疫苗准备了材料。 1．为了探索乳酸杆菌在鹅养殖业中的应用，首先本研究对鹅肠道乳酸杆菌进行了调查，结果表明雏鹅在20日龄时肠道的乳酸杆菌已达到较高的水平，最高可达10~8CFU／g。分离鉴定了15株乳酸杆菌，分别属于旧金山乳杆菌、发酵乳杆菌、弯曲乳杆菌、类高加索乳杆菌、瑞士乳杆菌、双发酵乳杆菌、小鼠乳杆菌、嗜淀粉乳杆菌和棒状乳杆菌棒状亚种。通过耐酸和耐胆盐试验表明L2和L8两株乳酸杆菌具有较强的耐受性，质粒检测均没有发现有质粒存在。 2．根据GenBank上注册的短小乳酸杆菌(L．brevis)S-层蛋白基因序列设计一对引物，采用PCR法获得了S-层蛋白信号肽基因，将其克隆到pMD18-T载体并测序。序列分析表明序列全长为352bp，其中编码信号肽部分的90bp的碱基与GenBank中Z14250的完全相同，生物信息学分析也表明这是一段信号肽基因，氨基酸序列分析也表明它具备信号肽的典型特征，结果表明本试验克隆得到了短小乳酸杆菌S-层蛋白信号肽基因。 3．根据GenBank中的鹅细小病毒B株全基因序列，设计合成一对引物，应用PCR技术扩增了鹅细小病毒强毒CHv株的VP3基因片段，将扩增后的VP3基因重组到pUC57载体上，并对插入片段进行序列测定，将测序结果及由该结果推导的氨基酸序列与国内外分离的GPV、MDPV、PPV和CPV等不同宿主来源的细小病毒的VP3进行生物信息学比较及分析。结果表明，我国四川分离的GPV CHv株VP3基因长1605bp，编码534个氨基酸，与国内外10株GPV的VP3基因进行比较，核苷酸同源性为93.4％-99.8％，氨基酸同源性为96.5％～99.3％，变异较小，是GPV保持一个血清型的分子基础。与番鸭细小病毒的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.6％和89.9％，而与其它种属的细小病毒同源性均在30％以下，表明它们与GPV CHv株亲缘关系较远。生物信息学分析表明它是一种疏水性的、稳定的、有强抗原性的膜外蛋白，有3个潜在的糖基化位点。 4．参照GenBank中发表的鸭IL-2基因保守序列，设计了一对引物，采用RT-PCR技术从ConA刺激的四川白鹅外周血淋巴细胞的总RNA中扩增出了鹅IL-2基因，并进行了克隆和测序。结果显示鹅IL-2基因全长468bp，含有一个441bp的ORF区，编码146个氨基酸。生物学软件分析表明该序列编码的氨基酸序列中有4个磷酸化位点，1个糖基化位点，含有21个氨基酸残基组成的信号肽。同源性分析表明四川白鹅IL-2基因与浙江白鹅的同源性极高，核苷酸和氨基酸同源性分别为99.8％和100％，与鸭、鸡和火鸡IL-2核苷酸及氨基酸序列同源性分别为92.2％、77.5％、78.2％和85.8％、65.5％、64.1％，而与其它种属的哺乳动物及啮齿类动物(如人、猴、大鼠、牛、马、猪、猫、小鼠、兔和鹿)的IL-2基因的核苷酸和氨基酸同源性分别低于45％和28％，进化树分析也表明四川白鹅IL-2基因与鸭和鸡具有较近的亲源关系。成熟蛋白IL2c基因全长为407bp，含有一个378bp的编码区，编码126个氨基酸。 5．首先通过酶切连接和PCR方法将SP基因与VP3基因连接，然后再利用酶切连接的方法通过在引物上加上一个由GSGGSGG 7个氨基酸组成的短肽将VP3基因与IL2c基因连接，从而构建成了VP3-IL2c的融合蛋白基因。将该融合基因连接到乳酸杆菌表达载体pMJ67中，获得了重组的分泌性表达载体pMJ-SP-VP3-IL2c，通过电转化方法，将其转化到乳酸杆菌L．casei，通过乳糖诱导，成功表达了融合蛋白，SDS-PAGE结果显示在约76kD处有一特异性条带，其分子量与融合蛋白基因所推导的蛋白质分子量相符。并对表达条件进行了优化，结果表明在诱导剂的浓度为0.5％，诱导剂加入时间为OD_(600)=0.5，诱导时间为20h时，可得到最高表达量。用兔抗GPV阳性血清进行West-blotting试验表明该重组表达的融合蛋白对GPV具有较好的免疫原性。采用Sepharose 4B琼脂糖凝胶为填料对重组表达蛋白进行分子筛层析，得到了纯度较高的重组蛋白。采用MTT法测定IL2c蛋白的活性，试验结果表明表达后的VP3-IL2c融合蛋白的淋巴细胞增殖系数可达3.84，表明IL2c蛋白具有生物学活性。