收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

乙型脑炎病毒—伪狂犬病病毒二联基因工程疫苗研究

徐静  
【摘要】: 乙型脑炎病毒和伪狂犬病病毒都是引起母猪繁殖障碍的重要病原之一,给养猪业造成巨大的经济损失。而且乙型脑炎是一种人畜共患病,猪是乙脑病毒的主要放大宿主,因此对猪乙脑病毒的控制具有十分重要的公共卫生意义。两种病原都是病毒,预防控制的主要措施除了常规的生物安全外,就是疫苗预防接种。目前尚无家畜专用的JEV疫苗株,主要用人类疫苗使用的弱毒株和强毒株。同时由于现代化养殖中猪群频繁接种,对猪群造成很大的应激,严重影响生产性能。目前,国际上动物用疫苗的发展趋势是标记疫苗及其配套的监测方法。鉴于此,本研究从乙脑病毒CQRC-1株扩增了主要免疫原性基因E、PrM,构建了两株表达乙脑病毒主要免疫原性基因的重组伪狂犬病病毒,即SA215(E)和SA215(F),并对两株重组病毒进行生物学特性研究。同时重组疫苗接种后需要一种特异的血清学鉴别方法,鉴于此对乙脑病毒非结构蛋白基因NS1进行原核表达,并建立了ELSIA方法。其主要的研究内容如下: 1.乙脑病毒PrM、E、NS1和NS3基因的克隆和测序 根据已报道的乙脑病毒CQRC-1株的核苷酸序列设计四对引物,在上下游引物的5'端引入一酶切位点。采用RT-PCR方法,扩增了PrM、E、NS1和NS3基因,分别利用TA克隆插入pMD18-Tsimple载体,命名为PrM-T、E-T、NS1-T和NS3-T。测序结果表明E基因与已公布的SA14、JaGAr01和P3株核苷酸同源性分别为97、97、96%;PrM同源性分别为97、97、96%;NS1同源性高达99、98、98%;NS3核苷酸同源性分别为99、98、98%;与报道的CQRC-1的对应序列相同。 2.表达JEV E和PrM基因的重组伪狂犬病病毒的构建 从E-T和PrM-T酶切获得JEV的E基因和PrM基因,分别插入到PRV gI基因缺失通用转移载体pPI-2.EGFP的多克隆位点中,构建转移质粒,命名为PPE和PPM。然后将质粒PPE和PPM分别与PRV基因缺失株SA215基因组共转染Vero细胞,通过同源重组,构建了融合表达JEV E基因和JEV PrM基因的重组伪狂犬病毒株,命名为SA215(E)和SA215(F)。经荧光检测、PCR、Southern转印杂交鉴定,结果表明SA215(E)和SA215(F)构建成功;Western免疫印迹检测表明JEV E基因和JEV PrM基因在重组病毒内获得表达,SA215(E)产生大小约90kD的融合蛋白;而SA215(F)产生大小约60kD融合蛋白,并且,表明产生的融合蛋白具有反应原性。 3.重组病毒SA215(E)、(F)部分生物学特性及稳定性 SA215(E)、(F)和SA215对Vero细胞的致病变效应、噬斑形态、一步法生长曲线试验以及电子显微镜观察病毒粒子形态特征。结果表明SA215在插入了JEV E或PrM基因后,并不改变其生物学特性。SA215(E)、(F)连续传6带,在荧光显微镜下可见荧光,用PCR跟踪检测仍可扩增出JEV E基因或PrM基因,表明SA215(E)、(F)至少在6代内稳定。 4.PRV-JEV二联基因工程疫苗对仔猪、小鼠和家兔的免疫原性和安全性试验 将重组伪狂犬病毒SA215(E)和(F)制成PRV-JEV二联基因工程疫苗接种小鼠、家兔和仔猪。并对该疫苗的免疫原性和安全性进行评价。重组伪狂犬病毒SA215(E)、SA215(F)、SA215和野毒Fa株分别以10~5TCID_(50)剂量接种小鼠,结果接种Fa株小鼠全部死亡,而接种SA215(E)、(F)和SA215株的小鼠全部存活;将四株分别以10~7TCID_(50)接种家兔,接种Fa的家兔在14天全都死亡,而接种SA215(E)、(F)和SA215株的家兔全部存活;初生仔猪接种SA215(E)和SA215(F)后除前三天体温升高外,其他正常。这些结果表明SA215(E)和(F)株的毒力显著低于PRV野毒株,而与亲本株SA215相近,初步验证了重组病毒的安全性。 将PRV-JEV二联基因工程疫苗SA215(E)、(F)及SA215分别加强免疫小鼠后,腹膜内攻毒JEV强毒株CQRC-1,结果显示SA215(E)能100%(8/8)的保护,SA215(F)仅50%(4/8)保护,而SA215完全不能保护小鼠JEV攻毒(0/8);血清中和试验表明SA215(E)接种两次后即首免后28天中和抗体滴度达1:20,而SA215(F)仅为1:4。SA215(E)、SA215(F)和SA215以10~7TCID_(50)接种家兔两次后,用10~7TCID_(50) PRV Fa株攻毒,SA215(E)、(F)和SA215都能100%(4/4)保护PRV强毒攻毒。淋巴细胞增殖试验(MTT法)结果显示SA215(E)和(F)能诱导小鼠特异脾淋巴细胞的增殖;而T细胞亚类数量的检测结果显示SA215(E)和SA215(F)免疫小鼠能有效提高T细胞数量,增强小鼠的免疫水平。这些结果表明重组伪狂犬病毒SA215(E)和SA215(F)制成的PRV-JEV二联基因工程疫苗能成功诱导小鼠产生细胞免疫和体液免疫应答。以上结果表明重组病毒SA215(E)可以作为预防猪乙脑和伪狂犬病的二联基因工程标记疫苗候选株。5.对已构建好的重组质粒NS1-T和NS3-T通过双酶切后。得到JEV NS1和NS3基因,将其亚克隆入原核表达载体pET-32a(+)中。在IPTG的诱导下,NS1和NS3基因以融合蛋白的形式进行表达。通过表达条件的优化,确立了NS1蛋白表达时的最佳诱导物浓度为0.4 mmol/L,诱导时间为4 h,诱导温度为37℃。以纯化的融合蛋白为抗原包被酶标板,优化抗原最佳包被浓度为10μg/ml,血清稀释度1:40,最适封闭液为1%BSA,血清反应时间为90min,酶标二抗HRP-SPA的工作浓度为1:2000,反应时间为60min,底物在室温显色时间为10min。根据已建立的ELISA方法及反应条件,确定阴阳性临界值为0.152。以建立的方法检测JEV血清学反应,能区分活毒感染与灭活疫苗接种,可作为二联基因工程疫苗SA215(E)的配套监测方法。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前19条
1 孙秋艳,朱瑞良,韩伟涛;禽用基因工程疫苗的特点及其存在的问题[J];山东家禽;2003年10期
2 孙宇辰;;基因工程疫苗的研究与应用[J];生物化工;2018年06期
3 邓秋红;丁春宇;刘玉倩;王占锋;郑杰;;我国兽用基因工程疫苗商品化进展[J];中国兽药杂志;2013年06期
4 木子;我国首株动物基因工程疫苗问世[J];畜牧兽医科技信息;2004年03期
5 童光志;禽用基因工程疫苗的研究进展及应用前景[J];中国家禽;2002年19期
6 ;基因工程疫苗前景及不足[J];国外医学(内科学分册);1998年02期
7 张树庸;中国研制出首剂禽类传染病基因工程疫苗[J];实验动物科学与管理;2005年02期
8 ;首株动物基因工程疫苗问世[J];中国牧业通讯.养殖场顾问;2004年03期
9 ;我国首株动物基因工程疫苗问世[J];湖南农业;2004年07期
10 ;我国首株动物基因工程疫苗问世[J];中国牧业通讯;2003年24期
11 苏天毅;;我国首株动物基因工程疫苗问世[J];农业知识;2004年06期
12 石素梅,郭聚明;“激生3号”基因工程疫苗对狼山鸡前期生长性能的影响[J];上海畜牧兽医通讯;2005年04期
13 储卫华,陆承平;鱼用基因工程疫苗研究与应用[J];海洋科学;2003年11期
14 ;基因工程疫苗[J];中国医学生物技术应用;2002年01期
15 吕武夫,李训芝;基因工程疫苗[J];甘肃畜牧兽医;1996年06期
16 安家骞;;几种基因工程疫苗的制备原理及使用优、缺点[J];养殖技术顾问;2011年05期
17 杨恒东;鸡传染性法氏囊病基因工程疫苗的研制[J];动物科学与动物医学;2003年11期
18 张继文;杨桂连;王春凤;;逆转录病毒载体在基因工程疫苗方面的应用[J];中国生物工程杂志;2010年06期
19 王伟青;周珍辉;曹授俊;安英凤;王振玲;;植物基因工程疫苗在畜牧业上的应用与发展前景[J];畜牧与兽医;2009年05期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王伟青;李玉冰;周珍辉;曹授俊;安英凤;王振玲;;植物基因工程疫苗在畜牧生产上的应用[A];京津冀畜牧兽医科技创新交流会暨新思想、新观点、新方法论坛论文集[C];2008年
2 孙晓萍;杨博辉;程胜利;郭健;;抑制素主动和被动免疫及其基因工程疫苗的构建[A];中国畜牧兽医学会养羊学分会全国养羊生产与学术研讨会议论文集[C];2005年
3 童光志;;禽用基因工程疫苗的研究现状及应用前景[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十一次学术研讨会论文集[C];2002年
4 张志芳;;家蚕杆状病毒生物反应器生产动物基因工程疫苗[A];培育生物产业,发展绿色经济——第五届中国生物产业大会·2011基因科学与产业发展论坛会刊[C];2011年
5 钱凤芹;;新城疫基因工程疫苗最新研究进展[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会论文集[C];2008年
6 王静林;张海林;周济华;梁国栋;;云南乙型脑炎病毒基因分型研究[A];第二届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2008年
7 王静林;张海林;周济华;梁国栋;;云南省乙型脑炎病毒基因分型及分子流行病学研究[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会成立大会暨第一次学术研讨会论文集[C];2008年
8 李越希;王正茂;管文燕;潘明洁;李琳;;单纯疱疹病毒基因工程疫苗的研制[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2010年学术交流会论文集[C];2010年
9 童光志;涂长春;;畜禽基因工程疫苗及诊断技术产业发展现状与前景[A];中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集(上册)[C];2004年
10 陈焕春;;动物基因工程疫苗创制及应用前景分析[A];2006中国微生物学会第九次全国会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 徐静;乙型脑炎病毒—伪狂犬病病毒二联基因工程疫苗研究[D];四川农业大学;2008年
2 王新;猪2型圆环病毒、猪细小病毒核酸疫苗及猪2型圆环—猪细小—伪狂犬病三价基因工程疫苗研究[D];四川农业大学;2007年
3 江云波;猪繁殖与呼吸综合征病毒新型基因工程疫苗研究[D];华中农业大学;2007年
4 李世华;基于乙脑病毒2'-O甲基转移酶的靶向减毒机制研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2015年
5 孙艳芳;乙型脑炎病毒对小鼠组织的嗜性及影响的形态学研究[D];华中农业大学;2011年
6 汤德元;乙脑病毒的分离鉴定和全长基因克隆的研究[D];四川农业大学;2004年
7 黄庆生;乙脑病毒全长cDNA的扩增、克隆及体外转录制备感染性转录体的研究[D];第四军医大学;1999年
8 潘晓玲;乙型脑炎病毒全基因组分子进化及基因重组研究[D];中国疾病预防控制中心;2009年
9 山丹;纤突蛋白高变区对传染性支气管炎病毒致病性、嗜性以及血清型影响的研究[D];中国农业科学院;2018年
10 楚电峰;表达H9亚型禽流感病毒血凝素的重组火鸡疱疹病毒构建及其安全性与免疫效力试验[D];扬州大学;2018年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张燕娜;兔病毒性出血症病毒SYBR Green RT-PCR检测方法的建立及其基因工程疫苗免疫保护研究[D];南京农业大学;2016年
2 郭逢林;日本脑炎病毒诱导p21相关的Foxo和Ca~(2+)信号通路研究[D];江西农业大学;2018年
3 郭欢欢;乙型脑炎病毒分型基因芯片的制备与初步研究[D];吉林农业大学;2012年
4 马淑娟;华南部分地区家猪流行性乙型脑炎病毒感染的流行病学调查[D];南方医科大学;2015年
5 米丽开姆·托合提尼亚孜;山羊痘病毒KLP2基因缺失的重组病毒的纯化及ANK基因缺失病毒的构建[D];塔里木大学;2019年
6 付朋飞;表达猪细小病毒VP2蛋白的重组猪伪狂犬病毒的构建及其免疫效力研究[D];河南农业大学;2015年
7 蒋思;Ⅰ型单纯疱疹病毒UL2蛋白核输入信号和核输入机制的鉴定及其重组病毒的构建[D];广州医科大学;2018年
8 谢永兴;表达PCV2-Cap蛋白和PPV1-VP2蛋白的重组伪狂犬病病毒的构建及其免疫原性研究[D];中国农业科学院;2018年
9 潘瑞;表达HBsAg的重组病毒联合免疫和pVR-IL15基因佐剂的免疫效果研究[D];中国疾病预防控制中心;2016年
10 郑文亚;乙型脑炎病毒四川株的分离鉴定及其生物学特性研究[D];四川农业大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 乔地;我国首个猪用基因工程疫苗将上市[N];科技日报;2017年
2 张锐鑫 张炜 郑世孝;我国兽用基因工程疫苗研发相对滞后[N];中国畜牧兽医报;2014年
3 记者 张锐鑫 通讯员 张炜 郑世孝;基因工程疫苗将有“洛阳造”[N];洛阳日报;2014年
4 见习记者 孔颖超;康宝基因工程疫苗项目开工[N];长治日报;2011年
5 汉文;首剂禽类基因工程疫苗在鄂诞生[N];中国畜牧兽医报;2005年
6 记者 陈卫东;上海内蒙古联合实施基因工程疫苗产业化[N];科技日报;2000年
7 潘社群;戴长柏:基因工程疫苗及多肽研究“排头兵”[N];昆明日报;2008年
8 吕月琴;为基因工程疫苗再添新活力[N];大众科技报;2008年
9 ;禽畜“医保”听令基因工程疫苗[N];天津日报;2006年
10 记者 张锐鑫 通讯员 郑世孝;“洛阳造”基因工程疫苗,中国首创![N];洛阳日报;2016年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978