收藏本站
《四川农业大学》 2008年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

神经内分泌因子及代谢产物对体外培养犊牛肝细胞PEPCK、SCD及脂肪细胞HSL基因表达的调控研究

邓俊良  
【摘要】: 以围产期能量代谢障碍为病理学基础的酮病和脂肪肝是奶牛重要的群发性常见多发病。研究表明,酮病、脂肪肝是奶牛能量负平衡的结果,脂肪动员、肝脂沉积、低糖血症和酮体生成增多是奶牛酮病和脂肪肝的主要环节。 围产期奶牛能量代谢特点是干物质摄入减少及能量负平衡,糖异生是反刍兽生糖的主要途径,磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)是糖异生途径的主要关键酶,通过上调PEPCK基因的表达量可直接影响肝脏糖异生的能力,从而缓解低血糖。 脂肪动员是缓解能量负平衡的唯一途径。一方面弥补糖异生作用降低所引起的能量亏欠;另一方面释放大量游离脂肪酸(NEFA)进入血液及肝脏,可引发脂肪肝和酮病。而脂肪动员是由甘油三酯脂肪酶(又称激素敏感脂肪酶HSL)催化完成的。HSL的表达量直接体现脂肪动员的程度,所以调控脂肪动员是防治脂肪肝、酮病等围产期能量代谢障碍性疾病的重要措施。 肝脂沉积也是脂肪肝、酮病发病根源之一。在肝脂沉积过程中,硬脂酰CoA去饱和酶(SCD)是单不饱和脂肪酸(MUFA)生物合成的限速酶,SCD可促进甘油三酯(TG)合成底物的形成,从而促进TG的合成。所以调控SCD酶的表达能直接调控脂肪的合成。 而神经内分泌因子和代谢产物是调节糖代谢、脂肪代谢,缓解酮病和脂肪肝的主要途径。因此本研究将通过体外(肝细胞和脂肪细胞培养)途径,运用分子生物学技术(定量RT-PCR、荧光定量PCR法),重点研究部分神经内分泌因子及代谢中间产物对奶牛糖异生关键酶(PEPCK)、甘油三酯合成关键酶(SCD)基因表达和脂肪动员关键酶(HSL)的活性及基因表达的分子调控机制。阐明神经内分泌因子及代谢中间产物在奶牛酮病、甘油三酯合成、脂肪动员中的调控作用,为从基因水平和蛋白质水平揭示奶牛酮病、脂肪肝发病机制奠定分子生物学基础和理论依据。 实验选取临床检查健康的新生荷斯坦犊牛,按照本实验建立的犊牛肝细胞原代单层培养方法进行培养,观察其生长形态,肝细胞培养至48h完全贴壁,为加样的最佳时机。 以β-actin为内参,以相同的cDNA为模板,优化了RT-PCR反映条件,成功地对目的基因(PEPCK、β-actin)进行了克隆扩增、克隆、鉴定及测序,测序结果与GeneBank报道一致。在肝细胞培养到48h时,分别在培养液中添加0、1、10、100和1000nmol/mL胰岛素(INS),0、1、10、100和500pg/mL胰高血糖素(GN),0、5、10、15、20、30、40、50、60、100和150ng/mL胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ),每浓度梯度设三个重复。通过RT-PCR法检测INS、GN和IGF-Ⅰ对糖异生关键酶PEPCKmRNA表达的影响。 采用SYBR greenⅠ染料法建立了适时荧光定量PCR的优化反应条件,成功地对目的基因(β-actin、SCD)进行了扩增,两基因的扩增效率相同。在肝细胞培养到48h时,分别在培养液中添加0、5、10、20、50IU/mL的INS,0、50、100、500、1000pg/mL的GN,0、50、100、500、1000pg/mL神经肽Y(NPY),每浓度梯度设三个重复,以β-actin为内参基因,用荧光PCR方法检测肝细胞SCDmRNA的表达。 通过犊牛前脂肪细胞原代单层培养(整个培养期为14d),培养至第8、12d,用油红0工作液和台盼蓝工作液对脂肪细胞分别进行染色,观察其生长形态;第14d,脂肪细胞分化成大的单脂滴的脂肪细胞。此时,在生长良好的脂肪细胞培养介质中分别添加0、10、20、30、40、50μg/L的IGF-Ⅰ,0、100、250、500、750、1000nmol/L的胰高血糖素样肽Ⅰ(GLP-Ⅰ),0、10、20、40、80、160mg/L的地塞米松、0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mmol/L的油酸,0、10、20、30、40、50mg/L的乳酸(每浓度梯度设三个重复),再分别进行培养24h后提取细胞总RNA,通过荧光定量PER扩增,观察IGF-Ⅰ、GLP-Ⅰ、地塞米松、油酸及乳酸处理的脂肪细胞HSLmRNA丰度的变化。提取处理的脂肪细胞总蛋白,测定所提细胞总蛋白浓度,用脂肪酶测定试剂盒测定处理脂肪细胞HSL活性的变化。 结果显示: 1.INS和IGF-Ⅰ能显著下调体外培养犊牛肝细胞PEPCK基因表达,并呈现剂量依赖性,但INS浓度在1~10和100~1000nmol/mL时抑制效应趋缓;IGF-Ⅰ浓度在10~15ng/mL时抑制效果稍趋平缓外,其抑制作用有明显剂量依赖性,IGF-Ⅰ>100ng/mL后几乎检测不到PEPCK。GN能促进犊牛肝细胞PEPCK基因mRNA的表达,具有浓度依耐性,各浓度组间差异极显著,在10~100pg/mL时促进效果最明显,浓度≥100pg/mL上调效应趋于饱和。因此,INS和IGF-Ⅰ通过减弱而GN通过促进肝PEPCKmRNA表达来调节肝糖异生。 2.INS浓度≥5IU/mL、NPY浓度≥50pg/mL对体外培养的犊牛肝细胞SCDmRNA表达有明显促进肝脏,且呈剂量依赖促进效应。GN浓度≥50pg/mL明显抑制肝脏SCDmRNA表达,且呈剂量依赖抑制效应。由此表明,INS和NPY可通过促进SCDmRNA表达,促进肝脂沉积:而GN可通过抑制SCDmRNA表达,减少肝脂沉积。 3.IGF-Ⅰ、GLP-Ⅰ、油酸、乳酸对体外培养脂肪细胞HSLmRNA表达及酶活性均呈现明显抑制作用,并存在剂量依赖性。IGF-Ⅰ浓度≥20μg/L对HSLmRNA的表达抑制作用显著,浓度≥30μg/L对酶活性抑制作用显著;GLP-Ⅰ浓度≥100nmol/L对HSLmRNA表达及酶活性抑制作用显著:油酸浓度≥1.0mmol/L显著抑制HSLmRNA表达,浓度≥0.5mmol/L极显著抑制HSL活性;乳酸浓度≥20mg/L显著抑制HSLmRNA表达,浓度≥40mg/L显著抑制HSL活性。地塞米松浓度≥20mg/L显著促进HSLmRNA表达,浓度≥10mg/L显著促进HSL活性。表明IGF-Ⅰ、GLP-Ⅰ、乳酸、油酸、地塞米松可通过影响奶牛脂肪细胞内HSLmRNA表达和酶活性影响脂肪代谢,除地塞米松可促进脂肪分解外,GF-Ⅰ、GLP-Ⅰ、乳酸、油酸均抑制脂肪分解,促进脂肪的沉积。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S858.23

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 董秀梅;晁青;王柏臣;;植物磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)研究进展[J];植物学报;2013年03期
2 刘满江;闫世林;;氯吡格雷对急性冠脉综合征患者血清sCD_(40)L的影响[J];基层医学论坛;2008年28期
3 李炯,沈德义,沈敏祺;sCD_(44V6)检测对非小细胞肺癌的临床意义[J];肿瘤研究与临床;2005年01期
4 郑星道,吴延春,魏素华,桑国样,赵志喜;SCD—Ⅱ型兽医用超声多普勒检测仪对乳牛早期怀孕诊断的试验研究[J];吉林农业大学学报;1988年04期
5 史子林;李建忠;刘贵之;白永志;陈桂娥;;使用SCD——2型兽医用超声多普勒检测仪对黑白花奶牛妊娠早期诊断的初报[J];中国奶牛;1988年02期
6 郑星道;宋怀燕;于明;;SCD-Ⅱ兽医用超声多普勒检测仪对家兔早期怀孕诊断的试验研究[J];吉林畜牧兽医;1988年05期
7 付剑云;苏又苏;杜冀辉;吴京兰;方红城;王执兵;谢培益;陈少源;;术前sCD_(40)L预测冠状动脉支架后再狭窄的临床价值研究[J];临床医药实践杂志;2008年14期
8 俞菊华;戈贤平;唐永凯;刘波;;碳水化合物、脂肪对翘嘴红鲌PEPCK基因表达的影响[J];水产学报;2007年03期
9 于清;曹志艳;董金皋;;玉米大斑病菌小柱孢酮脱水酶基因(scd)的克隆与功能分析[J];微生物学报;2007年06期
10 戈贤平;俞菊华;吴婷婷;;翘嘴红鲌PEPCK基因的克隆和序列分析[J];中国水产科学;2006年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 李玉艳;张礼生;David L.Denlinger;陈红印;;丽蝇蛹集金小蜂PEPCK基因的分子特征及其在滞育和逆境胁迫下的表达量分析[A];病虫害绿色防控与农产品质量安全——中国植物保护学会2015年学术年会论文集[C];2015年
2 陈忠琦;李转见;屈玉娇;刘艳丽;蓝贤勇;雷初朝;房兴堂;陈宏;;SCD基因在两个奶山羊品种中的酶切多态性分析[A];中国畜牧兽医学会养羊学分会全国养羊生产与学术研讨会议论文集[C];2010年
3 冯凯;王姮;孙琦;萧新华;;胰岛素等对PEPCK启动子顺反式作用的研究[A];中华医学会第六次全国内分泌学术会议论文汇编[C];2001年
4 郝攀;刘晶;刘群;;弓形虫SCD过表达虫株的构建及其表型变化[A];中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会论文集[C];2015年
5 郝攀;刘晶;刘群;;弓形虫SCD过表达虫株发生内质网应激[A];中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会论文集[C];2015年
6 付振中;赵合计;董玉振;;基于HSL颜色空间的模糊C均值彩色图像分割方法[A];第三届和谐人机环境联合学术会议(HHME2007)论文集[C];2007年
7 郑丁;时昭红;郭洁;张书;付丽鹤;刘凡;涂蓓蕾;;葱白提取物对非酒精性脂肪肝模型大鼠PGC-1α和PEPCK、G6Pase的影响[A];第三十届全国中西医结合消化系统疾病学术会议论文集[C];2018年
8 王于仨;杨彦佶;刘晓艳;崔苇苇;陈勇;李炜;韩大炜;李茂顺;王娟;霍嘉;陈田祥;胡渭;陆波;张艺;朱玥;尹国和;张子良;;SCD性能测试及能量响应标定[A];中国空间科学学会空间探测专业委员会第二十六届全国空间探测学术研讨会会议论文集[C];2013年
9 ;Effects of Non-esterified Fatty Acids on the Gluconeogenesis in Bovine Hepatocytes[A];中国畜牧兽医学会家畜内科学分会第七届代表大会暨学术研讨会论文集(上册)[C];2011年
10 ;Influence of IGF-1 on pyruvate carboxylase(PC) and phosphoenolpyruvate carboxykinase(PEPCK)mRNA expression and enzyme activity in calf hepatocytes cultured in vitro[A];中国畜牧兽医学会——第三届中国兽医临床大会论文集[C];2012年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 孙国根 黄辛;改变酶活性 防治糖尿病[N];科学时报;2011年
2 通讯员 孙国根 记者 姜澎;人类代谢调控领域获新突破[N];文汇报;2011年
3 本报记者 孙昕;合理膳食+运动 远离脂肪肝[N];联合日报;2017年
4 记者 王小龙;混合肝细胞能让肝组织安全再生[N];科技日报;2015年
5 ;促肝细胞生长药物在中国得到批准[N];中国高新技术产业导报;2001年
6 陈继培;乙肝最终都会癌变吗[N];中国石油报;2001年
7 杨六香;请给肝脏“减肥”[N];中国医药报;2002年
8 洪 玉;何来如此多的脂肪肝?[N];中国中医药报;2004年
9 欣光;移植猪肝细胞首获成功[N];华夏时报;2002年
10 黎明 译;基因治疗:新基因会传给下一代吗[N];科技日报;2002年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 邓俊良;神经内分泌因子及代谢产物对体外培养犊牛肝细胞PEPCK、SCD及脂肪细胞HSL基因表达的调控研究[D];四川农业大学;2008年
2 任子健;PEPCK-C~(mus)转基因西藏小型猪的构建与表型分析[D];南京医科大学;2015年
3 李杨;SIRT2通过调控PEPCK1表达增强细胞线粒体代谢促进胃癌侵袭转移的机制研究[D];南京医科大学;2018年
4 蒋雯卿;乙酰化修饰调控代谢网络和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的机制的研究[D];复旦大学;2011年
5 黄海龙;重组脂联素对犊牛肝细胞糖异生的调控作用[D];吉林大学;2010年
6 何林文;紫菜叶状体遗传分析与PEPCK、PEPC在不同世代间的表达分析[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2012年
7 马瑞花;逆转糖酵解[D];华中科技大学;2013年
8 张黎力;基于HSL色度学的绿色翡翠颜色分级技术研究[D];中国地质大学;2017年
9 鲁燕华;肝细胞组织化反应器的构建及应用研究[D];浙江大学;2012年
10 王敏君;肝细胞的衰老特性及衰老逆转的研究[D];第二军医大学;2014年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李静怡;TIP60调控HSL乙酰化促进脂解的机制研究[D];厦门大学;2018年
2 李蓉;HSL的表达和活性与豚鼠精子发生的相关性研究[D];第一军医大学;2007年
3 郝健;共轭亚油酸和维生素A对蛋鸡生产性能和SCD影响的研究[D];东北农业大学;2014年
4 陈忠琦;奶山羊SCD基因的克隆、多态性检测及其与经济性状的关联分析[D];西北农林科技大学;2010年
5 段霁航;乌克兰鱗鲤PK、PEPCK基因的克隆及其对不同糖水平的应答[D];天津农学院;2015年
6 李佳蔚;南方鲇两种糖代谢关键酶的克隆及表达模式的初步研究[D];重庆师范大学;2012年
7 滕炎玲;西农萨能奶山羊ATGL与HSL基因的cDNA克隆、序列分析与表达研究[D];西北农林科技大学;2010年
8 李超林;抵抗素对大鼠肝细胞GK与PEPCK活性及基因表达的影响[D];重庆医科大学;2005年
9 龚明;脂联素对正常大鼠肝细胞GK与PEPCK酶活性与mRNA表达的影响[D];重庆医科大学;2005年
10 程善燕;日粮不同能量水平对绵羊屠宰性能及不同组织中HSL基因表达的影响[D];河北农业大学;2010年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026