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《四川农业大学》 2009年
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寄生隐丛赤壳菌毒素化学及其致病机理的研究

韩珊  
【摘要】: 本论文在研究板栗疫病的病原菌产毒条件的基础上,通过有机溶剂浸提获得了病菌的粗提毒素,用生物测定的方法明确了所提取的粗毒素的致病作用及致病范围,并用粗毒素进行了抗性鉴定:进一步采用柱层析、HPLC分析等从粗提毒素中获得了毒素纯品,用质谱、核磁共振、红外光谱对毒素的分子结构进行了鉴定:在板栗植株和细胞的水平,通过对其生理生化的测定及组织超微结构的观察进行致病机理的研究:并以Cp-Ⅱ毒素为诱导因子诱导具有抗性的板栗愈伤组织,获得如下主要结果: 1.寄生隐丛赤壳菌在供试的液体培养基中可以产生对板栗有毒性作用的毒素,为了得到寄生隐丛赤壳菌的最佳产毒条件,本实验对该病菌的产毒培养条件及致病范围进行了研究。结果表明:不同培养液的产毒能力有明显的差异,7种培养液中,PD+板栗煎汁培养液产毒能力最强;栗疫病病菌产毒能力以培养温度为26℃,培养基pH值为6,振荡培养(120 r/min)条件下培养18 d生物活性最强;最佳氮源为蛋白胨,较好的碳源为糊精。试验选择中国板栗当年生幼嫩枝条进行粗毒素生物检测,表明培养得到的毒素原液具有一定的毒性。通过对致病范围的测定结果显示,在供试的25科33种植物中除对板栗有致病作用外,对其它不同科属的多种植物也具有致病活性,表明该毒素是一种非专化型毒素。 2.寄生隐丛赤壳菌(Cryphonectria parasitica)经液体培养,石油醚萃取其发酵液获得对板栗带叶嫩枝具有致萎活性的粗提物,以氯仿:石油醚:甲醇(6:2:2)、正丁醇:水:甲醇(8:1:1.5)作洗脱剂,粗提物经硅胶色谱分离,共得到3种纯毒素,分别为Cp-Ⅰ、Cp-Ⅱ、Cp-Ⅲ,3组份都对板栗幼苗致萎活性较高。质谱、核磁共振和红外光谱测定表明:Cp-Ⅰ分子量为278,化学式为C_(16)H_(22)O_4,化学名称为:dibutyl phthalate;Cp-Ⅱ分子量为157,化学式为C_9H_(19)ON,化学名称为1-(4-ethylpiperidin-1-yl)pmpan-2-one;Cp-Ⅲ分子量为128,化学式为C_7H_(14)ON,3-propylmorpholine。其化学结构式分别为: 3.应用酶活力测定的方法,研究板栗Castanea mollissima Blume不同抗性品种叶组织经栗疫菌Cryphonectria parasitica毒素Cp-处理后对其过氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响。结果表明:适宜浓度(25-50μg/mL)的Cp-Ⅱ毒素处理板栗叶片,能提高保护性酶SOD、POD、CAT、APX、PPO和PAL的活性,抗病品种(北裕2号)活性变化幅度最大;随着毒素处理浓度升高,活性氧清除系统开始受到破坏,各品种的酶活性相继下降:Cp-Ⅱ毒素处理浓度达200μg/mL时,破坏了板栗叶片中的抗氧化酶系,造成活性氧过量积累,APX、PPO和PAL的活性随之降低,最终导致植物受到伤害最终导致植物受到破害;可溶性蛋白和可溶性糖含量先升后降,电导率和MDA含量升高,保护性酶SOD和CAT的活性升高及POD活性下降。Cp-Ⅱ毒素引起寄主的这种生理生化规律性变化可作为抗性鉴定的一种评价指标。 4.用寄生隐丛赤壳菌产生的具致萎活性的Cp-Ⅱ毒素处理板栗带叶嫩枝,研究毒素对叶组织、茎组织超微结构的影响。结果表明:清水处理后的板栗叶片,其叶肉细胞超微结构比较清晰,细胞质致密,可见排列整齐的细胞结构。随着毒素浓度的增加,叶细胞的细胞壁变形,质壁分离,质膜断裂,叶绿体膜、线粒体膜、核膜膨胀、断裂,内部间质电子透明化,叶绿体片层排列紊乱,线粒体脊膨胀甚至消失,损害发生早和严重的是叶绿体片层和质膜,抗病品种的膜系统比感病品种的受害轻。茎组织经毒素处理后,感品种茎组织细胞均出现细胞壁变形甚至断裂,质膜断裂,叶绿体变形严重,类囊体片层解体,叶绿体膜膨胀、断裂;抗病品种变化较小。 5.本研究以栗疫病抗病品种北裕2号和感病品种红光愈伤组织为材料,用Cp-Ⅱ毒素处理板栗愈伤组织,对处理后的愈伤组织进行细胞超微结构观察,测定其体内β-1,3-葡聚糖酶与几丁质酶活性,筛选具有抗性的愈伤组织。结果显示:Cp-Ⅱ毒素处理后的红光细胞膜对毒素的作用最敏感,北裕2号的愈伤组织变化较红光出现的晚;对毒素处理的愈伤组织的几丁质酶与β-1,3-葡聚糖酶活性测定结果表明,抗病品种比感病品种酶的活性增加幅度大、时间早,且两种酶的活性在毒素处理后均不同程度地高于对照;Cp-Ⅱ毒素浓度为50μg/mL胁迫愈伤组织28 d以后,经抗性分析感病病品种更易诱导出具有抗性的愈伤组织。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S436.64

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