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《四川农业大学》 2009年
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虎杖愈伤组织白藜芦醇次生代谢调控体系研究

文涛  
【摘要】: 虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.)为多年生蓼科草本植物,是我国传统中药,其主要活性成分白藜芦醇(Resveratrol)是一种天然抗毒素,同时具有多种药理作用,被誉为最有前途的抗癌药物之一。为了实现该药用植物资源的可持续利用,以获得高含量的白藜芦醇为目标,本研究建立了虎杖愈伤组织无性系。从愈伤组织的光、温培养条件、前体物质苯丙氨酸的添加,以及真菌诱导子、水杨酸与紫外线诱导方面对其展开了系统研究,并通过对诱导培养过程中虎杖愈伤组织生理生化变化的分析,探讨了调控措施对愈伤组织中白藜芦醇生物合成的影响,建立了提高虎杖愈伤组织白藜芦醇含量的调控技术。并得出以下主要结论: 1.通过研究外植体和培养基对愈伤组织的影响,了解到以茎段作为外植体,其愈伤组织生长比叶片快,且其中的白藜芦醇含量为叶片中的5倍;MS培养基上的愈伤组织增殖量最多,其茎段和叶片的鲜重增长率均极显著高于N6和B5培养基,分别达到了141.0%和73.8%,但鲜样中白藜芦醇含量略低于B5培养基。因此,以MS为基本培养基,茎段为外植体诱导出的愈伤组织成愈较高,生长旺盛,维持时间长,白藜芦醇含量高,优于其他处理。 2.通过分析愈伤组织生长与白藜芦醇含量的关系,可见在愈伤组织生长最快时期,白藜芦醇含量增加也达到最高,因此对于虎杖愈伤组织的收获应选择在愈伤组织快速生长达到饱和时的时期,整个培养可在同一种培养基中完成。 3.通过正交实验研究了溶剂种类、时间、温度对愈伤组织中白藜芦醇提取率的影响,极差分析结果显示,提取工艺过程中最重要的因素为提取温度,其次是提取时间,而提取溶剂对白藜芦醇提取率的影响最小。综合评价各指标,用乙酸乙酯在4℃下提取48 h效果最佳。 4.将茎段诱导出的愈伤组织,分别置于暗光(0 lx)、弱光(1340~1560 lx)、强光(3110~3310 lx)三个条件下进行培养,结果显示,愈伤组织的生物量随着光照强度的增强而增加,强光培养下愈伤组织的生物量达到了53.682 g/LFW。但白藜芦醇含量与光照强度不成正相关,弱光培养下,愈伤组织中白藜芦醇的含量显著高于另外两个处理,为140.074μg/gDW。因此虎杖愈伤组织对光敏感,以弱光培养效果最好。25℃培养条件下茎段愈伤组织生长速度适宜,愈伤组织出现较早,愈伤组织中白藜芦醇含量最高。 5.通过不同浓度前体物质苯丙氨酸饲喂虎杖愈伤组织,研究发现10~30 mg/L浓度的苯丙氨酸能促进愈伤组织生物量的增殖,20 mg/L处理愈伤组织生物量增殖最多。用Richards方程模拟愈伤组织的生物量在一个生长周期内的动态积累过程,可以稳健、可靠地估计不加前体物质愈伤组织的生长动态变化,发现苯丙氨酸在一定程度上调节了愈伤组织的增长情况。由生长速率参数(K)可知,随着苯丙氨酸浓度的增加,愈伤组织增长速度加快,极显著高于对照16.5倍以上。且白藜芦醇含量也随着苯丙氨酸浓度的增加而增加,30mg/L处理白藜芦醇的含量达到最大值,鲜样、干样中分别为18.025μg/g和241.489μg/g,较对照高出16.8%和5.7%。 6.前体物质苯丙氨酸能诱导苯丙氨酸裂解酶(PAL)活性的增高,PAL的活性表现出随着添加的苯丙氨酸浓度的增大而升高。各处理PAL活性的变化趋势基本一致,都在培养的第7d达到最大值,表明培养前期,苯丙氨酸浓度的增加促进了PAL活性的增强,为白藜芦醇的合成提供了充足的底物,促进了白藜芦醇的合成。此外添加适量的前体物质能延缓虎杖愈伤组织细胞的衰老,增强愈伤组织的抗性。 7.通过以黑曲霉、青霉、啤酒酵母和灰葡萄孢的粗提物为诱导子对愈伤组织进行诱导,发现黑曲霉诱导子对白藜芦醇合成的促进作用最为显著,比对照提高了50.2%,表明虎杖对真菌诱导子种类具有选择性。同时研究发现以100 mg/L的黑曲霉诱导子效果最好,比对照高128.9%。同时,诱导子添加时间不同对愈伤组织和白藜芦醇含量的影响不同,以第0d加入白藜芦醇含量最高,但对愈伤组织生物量的积累有抑制作用,而在第14d和21d加入诱导子对愈伤组织生物量的积累没有影响。在诱导培养过程中,分析白藜芦醇含量的变化规律发现,培养到第6天白藜芦醇含量达到最高,为227μg/g,而在第6天后白藜芦醇含量开始下降。综合分析可得到虎杖愈伤组织真菌诱导优化方案:在接种后第14d加入100mg/L的黑曲霉诱导子,诱导培养6d后收获,可以使处理中白藜芦醇的含量比对照提高2.25倍。 8.对黑曲霉诱导子组分分离研究结果表明,黑曲霉诱导子提取液中主要是真菌壁多糖诱导了愈伤组织中白藜芦醇的生物合成,而蛋白质对愈伤组织中白藜芦醇的合成有抑制作用。 9.通过分析真菌诱导子对虎杖愈伤组织中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)酶活性的影响、内源激素脱落酸(ABA)的变化以及POD和CAT同工酶变化,研究发现真菌诱导子刺激后在培养第1d到第4d内源ABA含量大量产生,呈急剧上升趋势,在第4d达到峰值,PAL活性迅速增加,也在第4d达到最高;同时在培养的前3d,SOD和POD酶活性下降,CAT在第2d出现第一次高峰:当培养到第5d至第6d,对照与诱导处理之间出现很大的差异,SOD与POD活性诱导处理突然出现下降再急剧上升的趋势,而对照则维持较高水平;CAT在第5天出现第二次高峰;POD同工酶有新酶带的出现。 10.通过对水杨酸添加浓度、加入时间、诱导时间的筛选,发现在接种后第14d加入7mg/L的水杨酸,诱导6d的效果最好,可以使白藜芦醇比对照高近1倍,但诱导效果不及黑曲霉诱导子。黑曲霉诱导子与水杨酸、苯丙氨酸的进行不同组合,研究发现各组合对白藜芦醇的合成均有一定促进作用但与单独添加黑曲霉诱导子相比变化不大,黑曲霉诱导子、水杨酸和苯丙氨酸三种物质组合效果最好。 11.紫外光(30W)下20cm处照射,每次照射15 min,停止5 min,重复照射6次,2h照射时间处理,不能提高愈伤组织中自藜芦醇含量。 12.建立了提高虎杖中白藜芦醇含量的调控技术,以虎杖茎段为外植体,在MS+6-BA 1.0+KT 0.2~0.5+NAA 0.2(mg/L)培养基上建立愈伤无性系,转接于液体培养基上,在继代后第14天加入黑曲霉粗提物100 mg/L为诱导子。同时饲喂20mg/L苯丙氨酸和微量水杨酸,在弱光1300lx,25℃培养,加入后第6天收获,可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量达3倍以上。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S567.239

【参考文献】
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