收藏本站
《四川农业大学》 2009年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

高效木聚糖酶基因工程菌的构建及重组酶酶学性质与功效研究

何军  
【摘要】: 为获得较为优良的木聚糖酶基因工程菌株,本研究以里氏木霉木聚糖酶Ⅱ(Xyn2)的cDNA为目的基因,分别构建了大肠杆菌(Escherichia coli)和毕赤酵母(Pichiapastoris)表达载体,并成功实现了异源表达;在此基础上,为改善重组酶热稳定性,将海栖热袍菌木聚糖酶A(Thermotoga maritima,XynA)的耐热结构域A2融合至Xyn2基因N-末端,实现了杂合基因在毕赤酵母中的分泌表达;系统研究了重组酶酶学性质,并初步评定了该酶在动物生产中的应用效果。主要研究内容及结果如下: 1.里氏木霉Xyn2基因的克隆和序列分析 利用RT-PCR技术成功从里氏木霉Rut C-30中扩增出Xyn2的cDNA序列,经序列分析证实,该cDNA开放阅读框全长573 bp,编码191个氨基酸;Rut C-30的Xyn2基因序列与另一诱变株VTT-D-79125完全相同;与野生型菌株QM6α相比,两个变异株Xyn2基因内部有两处碱基发生突变,分别是第13位的C变为T,第272的G变为A;这两个位点的突变导致Xyn2第15位氨基酸残基由His突变为Tyr,而91位的Gly则变为Gln;序列分析证实了这两个突变并非来自PCR扩增,而是在菌株的诱变选育过程中形成的。 2.里氏木霉Xyn2基因在大肠杆菌中的表达及重组酶酶学性质分析 将Xyn2基因分别克隆到E.coli高效表达载体pET28α(+)和pET30α(+)上,转化宿主菌后获得了能够诱导产生重组木聚糖酶的E.coli基因工程菌BL21-pET28α-Xyn2和BL21-pET30α-Xyn2,它们表达产生的重组酶Xyn228和Xyn230分子量分别为25kDa和27 kDa;对细胞破碎液酶活分析表明,其产量分别达到21.9 U/mL和39 U/mL;Xyn228和Xyn230最适反应温度均为50℃,最适反应pH均为5.0;与亲本酶相比,两种重组酶的热稳定性较好,在60℃下保温30 min后,Xyn228和Xyn230相对酶活分别维持在71%和65%。 3.里氏木霉Xyn2基因在毕赤酵母中的分泌表达及重组酶酶学性质分析 将Xyn2基因克隆到P.pastoris高效表达载体pPICZαA上,转化野生型毕赤酵母X-33后获得了一株基因工程PX-1,在甲醇诱导下,其表达产物PTX2能够有效分泌至培养基中,并且杂蛋白分泌量极少;重组酶PTX2分子量约为21 kDa,与亲本酶一致,在普通摇瓶中诱导,其产酶水平达到了近300 U/mL;PTX2最适反应温度为60℃,最适反应pH为6.0;该酶在50℃下相当稳定,在此温度下保温30 min后,其相对酶活可维持在90%以上;而在60℃下保温30 min后,PTX2相对酶活仅维持在30%左右;PTX2对燕麦木聚糖的亲和力强于桦木木聚糖,其K_m值分别0.9 mg/mL和1.2mg/mL;与亲本酶一样,PTX2不能与纤维素有效结合,但能与木聚糖结合;PTX2为内切型木聚糖酶,当以燕麦木聚糖为底物时,其水解产物主要为木二糖及木二糖以上的木寡糖,另有少量木糖。 4.耐热木聚糖酶基因Xyn2-A2的构建及其在毕赤酵母中的表达 通过基因全序列合成,将海栖热袍菌XynA的耐热结构域A2融合至Xyn2基因N-末端,成功构建了耐热木聚糖酶基因及其毕赤酵母表达载体pPICZαA-Xyn2-A2,转化毕赤酵母后获得了能够分泌表达耐热木聚糖酶的基因工程菌PXC-1;其重组酶PTXC2分子量大小为27 kDa,在普通摇瓶中进行诱导获得了约90 U/mL的表达水平:PTXC2最适反应温度为65℃,最适反应pH为6.0;该酶耐热性较PTX2有明显改善,在60℃下保温30 min后,PTXC2残余酶活高达74%;与PTX2和亲本酶相似,PTXC2对纤维素几乎没有结合能力,但PTXC2对木聚糖的结合力强于PTX2。 5.重组木聚糖酶小规模发酵制备及其应用效果评定 利用15 L自动发酵系统对毕赤酵母基因工程菌PX-1进行小规模诱导培养,重组酶PTX2产量提高了近一倍,最高达到了560 U/mL,且纯度较高;在仔猪饲粮中添加液体重组酶PTX2(500 U/kg),仔猪平均日增重提高了16.9%;饲粮粗蛋白、灰分、钙和粗纤维的表观消化率分别提高了1.7%、3.4%、2.5%和2.6%,该结果表明,重组酶PTX2能够部分消除饲粮中木聚糖的抗营养作用,改善动物生产性能。 综上所述,本研究构建了木聚糖酶E.coli基因工程菌,其重组酶活性较强,但表达水平偏低;利用毕赤酵母表达系统成功构建了可实现高效分泌表达的基因工程菌PX-1,其产酶量远高于原核表达系统,且重组酶纯度较高,热稳定性较亲本酶也有一定改善;经动物试验初步评定证实,该重组酶具有较好的应用效果;通过对木聚糖酶基因(Xyn2)结构的改造(耐热域融合)可显著改善重组酶热稳定性,但其表达水平偏低。因此如何兼顾重组酶产量与热稳定性是今后仍需要进一步解决的问题。
【学位授予单位】:

知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前16条
1 陈惠鹏,罗贵民,李惟,程玉华;棕色固氮菌含铁超氧化物歧化酶重组研究[J];生物化学杂志;1989年05期
2 魏莹;郭利川;张小平;黄雷;郑乐怡;应清界;吴忠华;郑伟;;重组酶介导扩增方法快速检测A族乙型溶血性链球菌[J];中国国境卫生检疫杂志;2018年05期
3 唐雪明,王正祥,邵蔚蓝,刘吉泉,方慧英,诸葛健;碱性蛋白酶工程菌发酵条件及重组酶的纯化和性质的研究[J];生物工程学报;2002年06期
4 王凡强,王正祥,刘吉泉,诸葛健;重组过氧化氢酶与一种商品过氧化氢酶的性质比较[J];食品与生物技术;2002年01期
5 郑伟;徐琦;罗鹏;冯娟;郭利川;应清界;;重组酶介导扩增方法快速检测黄热病毒[J];中国卫生检验杂志;2016年01期
6 刘冬虹;王德莲;郭燕华;聂炎炎;吴环;曾国权;;重组酶聚合酶扩增技术的研究进展[J];检验检疫学刊;2016年05期
7 孙国凤;;Novo公司在美国开始生产重组酶[J];生物技术通报;1991年09期
8 王文棋;盖颖;陆海;蒋湘宁;;重组酶Cre基因在大肠杆菌中的高效表达及其一步纯化和活性检测[J];北京林业大学学报;2006年03期
9 王卓;裴建军;李华钟;邵蔚蓝;;极耐热性β-葡萄糖醛酸酶的高效表达和酶学性质及其应用[J];生物工程学报;2008年08期
10 林福玉;杨晓;;条件基因打靶研究存在的主要问题及对策[J];遗传;2011年05期
11 夏立亮;侯巍;王保学;刘华;高伟;蒋琴;李鑫;于源华;;阴道毛滴虫蛋氨酸裂解酶的基因克隆及重组酶性质分析[J];中国生物工程杂志;2010年05期
12 周银;王跃驹;王瑛;;新型定点重组酶系统在植物基因转化和基因叠加中的应用前景[J];遗传;2008年02期
13 刘万顺;王娇;杨艳;韩宝芹;董文;刘光磊;池振明;;壳聚糖酶基因在解脂耶氏酵母中的表达及重组酶性质研究[J];中国海洋大学学报(自然科学版);2011年12期
14 杨东生;张研;张建会;杨春;;Cre/Loxp重组酶系统与转基因[J];安徽农业科学;2010年08期
15 沈微;林丽珍;黄雯雯;郭玉婉;陈献忠;樊游;王正祥;;一种酸性真菌α-淀粉酶的异源表达与重组酶性质[J];食品与发酵工业;2013年08期
16 张霖;赵国屏;丁晓明;;位点特异性重组系统的机理和应用[J];中国科学:生命科学;2010年12期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 程萱;翁土军;谭晓红;侯宁;王健;林福玉;黄培堂;杨晓;;成骨细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立[A];中国遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编(2004-2008)[C];2008年
2 谢胜松;徐娟;马武彬;刘强;陈金妹;黄行许;张永莲;;附睾头部特异表达Cre重组酶转基因小鼠模型的建立[A];第二届模式生物与人类健康研讨会会议论文集[C];2012年
3 焦裕冰;蒋均匀;夏子豪;吴元华;;基于重组酶聚合酶扩增技术检测黄瓜绿斑驳花叶病毒方法的建立[A];中国植物病理学会2018年学术年会论文集[C];2018年
4 韩文元;李文文;初明珠;倪金凤;申玉龙;;硫化叶菌重组酶RadA同源蛋白RadC功能的初步研究[A];2010年第四届全国微生物遗传学学术研讨会论文摘要集[C];2010年
5 董铭;于澎;陈嘉峰;孟红梅;饶明俐;田中庸介;;Knock in法建立Cre重组酶鼠系[A];中华医学会第十三次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2010年
6 王友亮;程萱;程竟;崔芳;吕娅歆;杨晓;;肝脏组织特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立[A];中国的遗传学研究——中国遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编[C];2003年
7 刘蓉蓉;王立霞;林忠平;;Cre重组酶的几种缺失突变及其对cre/lox重组活性的影响[A];第四届中国酶工程学术交流讨论会论文集[C];2003年
8 侯宁;王剑;李文龙;张继帅;杨晓;;心脏和软骨组织特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的基因型鉴定[A];中国遗传学会七届一次青年研讨会暨上海高校模式生物E——研究院第一届模式生物学术研讨会论文汇编[C];2005年
9 崔继哲;于胜楠;;利用Cre/loxP重组系统激活iaaH表达的研究[A];中国遗传学会植物遗传和基因组学专业委员会2009年学术研讨会论文摘要汇编[C];2009年
10 李丽;陈凌;柯丹如;刘志春;江一平;;EGFP-Cre重组酶真核表达重组质粒的构建及其表达[A];2007年中国解剖学会第十届全国组织学与胚胎学青年学术研讨会论文摘要汇编[C];2007年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 张建列 通讯员 黄博纯;科学家培育出带有基因剪刀的工具猪[N];广东科技报;2017年
2 叶世超 薛婷 何文锦叶 冰莹 魏芳 陈由强;木聚糖酶的应用及其研究进展[N];中国食品报;2014年
3 汤立平;木聚糖酶的性质及在酿酒方面的应用[N];中国食品安全报;2011年
4 沈诚 陈光杰 余学来 王亚龙;木聚糖酶在棉织物前处理中的应用[N];中国纺织报;2013年
5 ;木聚糖酶的性质及其在酿酒方面的应用[N];中国食品安全报;2011年
6 ;木聚糖酶的性质及在酿酒方面的应用[N];中国食品安全报;2011年
7 南方周末记者 黄永明;谜一样的致命大肠杆菌[N];南方周末;2011年
8 记者 刘伊婷;质检总局严密防控欧洲大肠杆菌疫情传入[N];中国质量报;2011年
9 记者 李婵;人与大肠杆菌:两个世纪的孽缘[N];北京科技报;2011年
10 记者 舒适;感染大肠杆菌 法国老妇身亡[N];新华每日电讯;2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 何军;高效木聚糖酶基因工程菌的构建及重组酶酶学性质与功效研究[D];四川农业大学;2009年
2 胡洪;角蛋白酶基因工程菌的构建和表达及重组酶酶学性质与功效研究[D];四川农业大学;2013年
3 Mohammed Mustafa Gumaa;动物布鲁氏菌感染重组酶聚合酶扩增检测方法的建立[D];中国农业科学院;2019年
4 刘辉;STELLA-CRE重组酶转基因小鼠的建立与特征鉴定[D];华中农业大学;2011年
5 郑敬民;基于重组酶作用的小鼠ES细胞HPRT基因位点转基因定点整合系统研究[D];第二军医大学;2001年
6 李鹏;利用体细胞核移植制备肾脏特异性表达Cre重组酶的转基因工具猪[D];吉林大学;2015年
7 陈立梅;诱导性表达Cre重组酶转基因猪的建立[D];吉林大学;2010年
8 韩铭海;弹性蛋白酶在毕赤酵母中表达及N-糖基化位点突变对重组酶的影响[D];江南大学;2013年
9 李秀婷;嗜热真菌Thermomyces lanuginosus耐热木聚糖酶性质及应用研究[D];中国农业大学;2004年
10 王磊;Cyc8-Tup1转录调控复合物在里氏木霉纤维素酶基因表达过程中的作用机制研究[D];山东大学;2019年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 周小玲;粗糙脉孢菌一种新植酸酶基因的克隆、鉴定和重组酶的生化特性[D];江南大学;2004年
2 孙益荣;Humicola insolens角质酶在Escherichia coli中的重组表达、发酵优化及其应用[D];江南大学;2018年
3 刘导志;人源CYP3A4和CYP2J2重组酶表达及其相关代谢研究[D];华东师范大学;2017年
4 李生;基于Phi29 DNA聚合酶和Cre重组酶的环状DNA分子等温扩增[D];天津大学;2017年
5 王凯风;基于重组酶聚合酶扩增技术的柯萨奇A6型病毒的快速检测方法的建立[D];南方医科大学;2017年
6 汪亮;重组酶删除载体的构建及其在动物细胞中的应用[D];东北农业大学;2009年
7 王丹丹;黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因工程菌的构建、高效表达及重组酶性质研究[D];新乡医学院;2015年
8 胥珊;几种不同NLS对重组酶删除效率影响的初步研究[D];西南大学;2009年
9 杨丽华;四环素诱导的Cre重组酶表达载体的构建及其体外表达研究[D];福建医科大学;2009年
10 杨春;肝特异性表达Cre重组酶载体和转基因猪成纤维细胞的构建[D];吉林大学;2008年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978