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《四川农业大学》 2009年
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维生素D_3对丝毛鸡β-防御素诱导表达及生长免疫性能的影响

李思明  
【摘要】: 防御素是家禽先天免疫的重要效应分子,在宿主抵御致病性微生物入侵时起至关重要的作用。维生素D_3(VD_3)作为一种免疫调节剂,能直接诱导哺乳动物单核细胞、上皮细胞等细胞系中抗菌肽和相关免疫因子的表达。然而,家禽体内尚未发现VD_3转化成1,25(OH)_2D_3活性形式的1α羟化酶。本研究旨在探讨VD_3与鸡体内β-防御素表达之间的关系,同时也探讨了VD_3对丝毛鸡生产免疫性能的影响,共包括以下六部分试验。 试验一注射VD_3对丝毛鸡β-防御素表达的影响 本试验旨在研究腹腔注射VD_3对丝毛乌骨鸡组织中β-防御素(β-defensins,AVBDs)、Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)、维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)和24羟化酶(CYP24)基因表达的影响。采用实时荧光定量PCR方法检测VD_3对6周龄丝毛乌鸡肝、肾、脾、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和法氏囊中AVBDs、TLRs、VDR和CYP24基因的表达变化。结果表明,在注射VD_3后24h内,6个AVBDs(AVBD-1、AVBD-5、AVBD-7、AVBD-9、AVBD-10和AVBD-12)、3个TLRs(TLR2、TLR6和TLR 7)、VDR和CYP24基因在肠道组织中均有显著的表达上调;TLR2、TLR5、VDR、AVBD-6、CYP24和GAL-1基因分别在肝、肾、脾组织也有显著的表达变化。结果提示,AVBDs、TLRs、VDR和CYP24基因的表达变化可能是受VD_3的诱导。 试验二注射沙门氏菌对丝毛鸡β-防御素基因表达的影响 本试验旨在研究腹腔注射灭活沙门氏菌对丝毛乌骨鸡组织中AVBDs和TLRs基因表达的影响。采用实时荧光定量PCR方法检测沙门氏菌对6周龄丝毛乌鸡胸腺、肝、肾、脾、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和法氏囊中AVBDs和TLRs基因的表达变化。结果表明,在注射后32h内的不同时间点,8个AVBDs(AVBD-1、GAL-1、AVBD-5、AVBD-6、AVBD-7、AVBD-9、AVBD-10和AVBD-12)和5个TLRs(TLR1、TLR4、TLR5、TLR6和TLR7)基因在丝毛乌鸡胸腺、肝、肾、脾、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和法氏囊中均有显著的表达上调。结果提示,在这9个组织中的8个AVBDs和5个TLRs基因的表达发生了大幅上调,AVBDs的表达可能是TLRs的介导所致。 试验三饲喂VD_3对丝毛鸡β-防御素基因表达的影响 本试验旨在研究VD_3饲喂剂量对丝毛乌骨鸡组织中AVBDs、TLRs、维生素D羟化酶结合蛋白(VDHA)和24羟化酶(CYP24)基因表达的影响。1—6周龄分别饲喂每千克饲料添加0、800、1600、3200和6400IU VD_3的饲粮。采用实时荧光定量PCR方法检测VD_3对6周龄丝毛乌鸡胸腺、肝、肾、脾、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和法氏囊中AVBDs、TLRs、VDHA和CYP24基因的表达变化。结果表明,在饲喂800、1600、3200和6400IU VD_3的不同处理中,6个AVBDs(AVBD-1、AVBD-5、AVBD-7、AVBD-9、AVBD-10和AVBD-12)基因在胸腺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和法氏囊组织中的表达均有显著的影响;TLR2、TLR5、VDHA、AVBD-6、CYP24和GAL-1基因分别在肝肾脾组织也有显著的表达变化。结果提示,AVBDs、TLRs、VDHA和CYP24基因的表达变化是受VD_3的诱导,且AVBDs的表达可能受TLRs、VDHA和CYP24基因的介导,其表达与VD_3存在剂量依赖性,适宜的VD_3饲喂剂量可以使β-防御素基因的表达上调。 试验四饲喂VD_3对丝毛鸡组织中免疫因子的影响 本试验旨在研究VD_3对丝毛鸡体内细胞因子IL-2和IL-18表达的影响,探讨其与细胞因子表达丰度的关系。采用VD_3饲喂模型,利用实时荧光定量PCR技术检测细胞因子在胸腺、肠道和法氏囊中的表达变化。结果表明,长期饲喂6400IU的VD_3有助于IL-18基因在丝毛鸡胸腺、法氏囊和肠道的表达上调。饲喂高剂量也有助于IL-2在十二指肠、法氏囊和盲肠的表达上调,但在胸腺、空肠和回肠中高剂量对其有抑制作用。结果提示,VD_3剂量跟丝毛鸡体内细胞因子IL-2和IL-18表达丰度相关,但其对不同组织中的细胞因子的调节存在差异。 试验五饲喂VD_3对丝毛鸡生长性能和免疫器官的影响 本试验旨在研究日粮中添加不同水平VD_3对丝毛鸡生长性能和胸腺、脾和法氏囊组织的影响。选用7日龄仔鸡120只,随机分为6个处理,每个处理20羽。试验日粮参照中国地方鸡推荐标准配制,6个处理的日粮VD_3水平分别为:0、400、800、1600、3200和6400 IU/kg。研究结果表明:在本试验范围内,增加日粮VD_3水平可以改善丝毛鸡日增重和平均体重。随着日粮VD_3水平的增加,脾脏和法氏囊组织的质量指数和细胞数随之提高,但不影响胸腺组织的质量指数和细胞数。由此可见,在试验范围内,提高日粮VD_3水平可以显著提高丝毛鸡生长性能,显著增加脾脏和法氏囊组织的脾脏指数和法氏囊指数及其细胞数。 试验六丝毛鸡β-防御素的组织表达分布及其基因片段的克隆与序列分析 用设计的特异性引物,运用Real-time PCR方法分析了丝毛鸡6个β-防御素基因在不同组织中的分布,结果发现:AVBD-1、AVBD-5、AVBD-7、AVBD-9、AVBD-10、AVBD-12的表达广泛分布在胸腺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和法氏囊组织中,但表达量有差异。同样采用RT-PCR方法扩增丝毛鸡β-防御素基因AVBD-10。通过克隆、测序获得AVBD-10基因的cDNA核苷酸序列,并提交到GenBank,比较分析其与GenBank中注册的防御素基因核苷酸序列的相似性,其核苷酸的相似性在88%~100%之间。利用DNAStar软件对所获得的丝毛鸡β-防御素AVBD-10基因进行系统发育树分析,结果AVBD-10与GenBank中注册的丝毛鸡防御素AVBD-10基因不在同一分支,可能是品种血缘不纯造成的差异。 总之,VD_3能诱导丝毛鸡体内防御素AVBDs的表达,其诱导功能的发挥与TLRs、VDHA和Cyp24的介导有关;适宜的VD_3饲喂剂量能上调组织中AVBDs、IL2、IL18基因的表达,提高生长性能和免疫器官质量指数。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S831.5

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