动物性食品源空肠弯曲杆菌的分离鉴定及其二重PCR检测方法的建立

【摘要】： 空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni)是一种重要的肠道致病菌,其感染率呈上升趋势。由于鸡猪等畜禽带菌可导致食品及水源污染传播,因此检测和控制食品原料及食品中空肠弯曲菌的污染极为重要。 1、根据GB/T4789.9-2003、SN0175-92、ISO10272-1:2006、FDA/BAM:2001、USDA/FSIS:1998等方法组合出一套对动物性食品源空肠弯曲杆菌有效的分离鉴定方法。运用该方法,从雅安市场上的鸡肉中首次分离到36株疑似空肠弯曲杆菌菌株,生化及16S rDNA的PCR鉴定表明,其中21株为空肠弯曲杆菌。将空肠弯曲杆菌标准菌株ATCC33560和随机选出的分离株SCCJ-08-5的16S rDNA克隆的序列分析表明,二者同源率100%。采用组合的生化检测法对四川雅安市鸡肉中空肠弯曲杆菌污染的调查表明其污染率为11.5%(21/183)。采用美国临床实验标准委员会(NCCLS)推荐的肉汤微量稀释法,测定了21株空肠弯曲杆菌对常见22种抗生素(组合)的耐药性,结果表明,14.3%的菌株对氨苄西林具有耐药性;所有菌株均对环丙沙星、四环素、红霉素不耐药;并测定了22种药物的MIC_(50)和MIC_(90)值。 2、根据空肠弯曲杆菌的hipO(马尿酸酶基因)及16S rDNA序列设计了两对特异引物,建立了一种特异、灵敏、快速的从动物性食品中检测空肠弯曲杆菌的二重PCR方法。结果表明该方法对空肠弯曲杆菌能特异的扩增出366bp和699bp两个基因片段,而大肠杆菌、沙门氏菌等其他11种细菌均未扩增出条带。空肠弯曲杆菌标准菌株ATCC33560和随机选出的分离株SCCJ-08-D2的16S rDNA及hipO基因片段克隆后序列分析结果与二重PCR结果一致。建立的二重PCR方法可在27h内完成,其灵敏度为2.4～16CFU/mL。二重PCR方法比传统的生化检测法简便、灵敏、快速,为基层卫生检验检疫机构提供了一种检测/监测食源空肠弯曲杆菌的新方法。采用二重PCR方法和组合的生化检测法对雅安市市场上采集的动物性食品样品进行空肠弯曲杆菌污染调查。结果显示,二重PCR方法检测鸡肉、猪肉、牛肉和牛奶样品中的空肠弯曲菌的阳性率分别为38.0%(19/50)、28.3%(15/53)、17.1%(6/35)及8.6%(4/46),组合的生化检测法检出的阳性率分别为16%(8/50)、9.4%(5/53)、5.7%(2/35)和2.2%(1/46),说明二重PCR方法具有比生化检测法更高的检出率。以上数据表明,四川雅安市动物性食品中空肠弯曲杆菌的污染率较高,居民消费的鸡肉、猪肉、牛肉和生牛奶如果加工不当或者饮食习惯不卫生,将对其健康构成潜在的威胁。