赖草属植物Myb基因的克隆及分子性状分析

【摘要】： 赖草属Leymus Hochst是禾本科Poaceae小麦族Triticeae Dumortier的一个重要多年生属,全世界有赖草属大约32个种和19个亚种,广泛分布于欧亚大陆和北美,南美也有少量分布。主要形态特征为：具根状茎、异花授粉、颖从锥形到披针形、外稃无芒或具短芒、小穗1到多枚着生于穗轴各节、花药长。赖草属植物通常生长于海滨、河湖沙岸、沙漠沙丘、草原、草甸、山坡及林下,有些赖草属物种具有抗病虫、穗大、粒多、高光效等优良特性。同时,该属大多数植物具有较强的耐寒、耐旱、耐碱,以及抗病、抗虫、抗风沙的能力,且是优良的牧草。对赖草属植物抗逆相关基因的研究具有重要的意义。 在植物抗逆反应体系中,通过转录因子调控功能基因的表达,是植物逆境应答反应的关键环节。作为植物体内最大的转录因子家族之一,Myb (v-Myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)类转录因子在植物抗逆胁迫过程中起着重要的作用,调节细胞的形态,参与激素和胁迫的应答。目前,在普通小麦中已经获得了大量的Myb基因序列,而在小麦近缘属物种中获得的同源基因则比较少,导致对麦类植物Myb基因家族成员间的关系还不清楚。因此,进行小麦近缘属物种Myb基因的研究是非常必要的。为了认识和利用赖草属植物的Myb基因,本研究对赖草属5种植物的Myb基因进行了克隆和分子性状分析,主要结果如下： 1.根据糜子Actin基因的保守序列为诱饵,在Genbank上找到三条同源性非常高的EST序列,拼接为全序列来设计一对简并性引物P1,并利用糜子Actin基因引物P2,以多枝赖草(Leymus multicaulis)叶片总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出Actin基因片段并连接到pMD18-T载体上。阳性克隆经PCR鉴定后进行测序,所得序列与GenBank中注册的Actin基因序列的同源性为81.8%-96%,与其它肌动蛋白的氨基酸序列的同源性达82%以上。序列分析表明,克隆到的为Actin基因,并分别命名为：LmACT1,长961 bp,编码312个氨基酸；LmACT2,长192 bp,编码42个氨基酸。并在GenBank注册,登录号为GU992386,GU992387。 2.根据Myb基因R2R3区域的保守性,设计简并性引物或Myb基因全长的特异引物,从赖草属5个物种中分离得到19个Myb基因片段,其中,16个片段包含R2R3域的部分序列,3个片段含有完整的开放阅读框的R2R3-Myb基因序列,氨基酸序列分析表明,19个Myb基因片段均属于R2R3-Myb成员。与典型R2R3-Myb基因的比较,赖草属植物19个Myb基因片段编码的R2R3区域氨基酸序列有3种构型：13个为W-x(19)W-x(19)W-x(12)F-x(18) W-x(18)W构型,4个为W-x(19)W-x(19) W-x(12)M-x(18)W-x(18)W型,2个为W-x(19)W-x(19)R-x(12)L-x(18)W-x(18)W型。 目前报道的小麦Myb基因编码的蛋白质中,第70位氨基酸全是苯丙氨酸(Phe-F),而赖草属植物的19个Myb基因编码的蛋白质中的第70位氨基酸出现了三种不同的氨基酸,即苯丙氨酸(Phe-F)13个,亮氨酸(Leu-L)2个和蛋氨酸(Met-M)4个,表明赖草属植物的Myb基因在该位点发生了变化,在同属中不同物种或同种的不同Myb基因成员存在多样性。 3.根据核酸序列的相似性,对赖草属植物的3个Myb全基因(LrMyb3,HM071921; LmMyb6,GU011687;LmMyb8,GU011688)进行系统分析。分析结果表明,LmMyb6、LmMyb8和LrMyb3基因与ZmMyb39, HvMyb4, TaMyb2首先聚类,它们序列相似性较高,亲缘关系较近。与LmMyb6、LmMyb8和LrMyb3相似性高的大多是一些与植物抗旱相关的Myb基因,因此,推测本研究中的LmMyb6、LmMyb8和LrMyb3与赖草属植物的抗旱性有关。 4.通过荧光定量,运用2-△△Ct分析法对多枝赖草LmMyb8基因在根、茎和叶的荧光相对定量分析,结果表明,LmMyb8在叶和根中的相对表达丰度高,茎较低,与玉米Myb基因在根、茎、叶的表达方式不一样,与小麦的TaMyb2, TaMyb3, TaMyb4和TaMyb6的表达方式相似。