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《四川农业大学》 2010年
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色氨酸对幼建鲤消化吸收能力和疾病抵抗能力及其组织器官中TOR表达影响研究

唐凌  
【摘要】: 本研究通过体内、体外实验相结合的方法,探索了幼建鲤消化酶活力及肠道刷状缘相关酶活力变化规律,在此研究基础上研究了色氨酸对幼建鲤生产性能,营养物质沉积效率,氨基酸代谢,消化吸收能力、免疫力以及蛋白质合成信号调控分子TOR基因表达的影响;运用鱼的原代细胞研究模型,研究了色氨酸对幼建鲤肠细胞增殖分化、蛋白质合成以及TOR基因表达的影响。主要的研究内容和结果如下: 1幼建鲤消化酶和肠道刷状缘相关酶活力变化规律研究 选择体重为18.0±0.2g的健康建鲤750尾,设5个阶段,每个阶段3个重复,每个重复50尾鱼,均饲喂相同饲粮,分别于0、14、28、42和56天采样,探索不同体重建鲤消化酶活力及肠道刷状缘相关酶活力的变化规律。结果发现:随幼建鲤体重(18.0-74.7g)增加,肝胰脏和肠道蛋白含量、消化酶活力呈极显著(P0.01)或显著(P0.05)升高。当建鲤体重为74.7g时,肝胰脏和肠道蛋白含量均显著高于其余各体重组(P0.05),肝胰脏胰蛋白酶和糜蛋白酶活力、肝胰脏和肠道淀粉酶活力均极显著高于其它各体重组(P0.01);当体重分别达到58.6,40.1,58.6和58.6g时,肝胰脏脂肪酶活力、肠道胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶活力分别进入平台值(P0.05)。随幼建鲤体重增加,其肠道刷状缘相关酶活力也呈极显著(P0.01)或显著(P0.05)升高。当幼建鲤体重为74.7g时,后肠Na+,K+-ATPase活力,前肠、中肠和后肠的碱性磷酸酶(AKP)、前肠γ-谷胱甘肽转氨酶(y-GT)活力均极显著高于其它各体重组(P0.01),中肠y-GT显著高于其余各体重组(P0.05);当幼建鲤体重达到58.6g时,全肠肌酸激酶(CK)活力、前肠和中肠Na+,K+-ATPase和后肠γ-GT活力均进入稳定值(P0.05)。研究结果表明:20-80g的幼建鲤随体重增加,胰腺分泌胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的能力增加,其分泌能力的增加与胰腺的发育逐步完善有关;肠道吸收能力随幼建鲤体重增加逐步提高,其吸收能力的提高与肠道的发育逐步完善有关。 2色氨酸(Trp)对幼建鲤生长、体成分沉积以及血清、肝胰脏和肌肉中GPT和GOT活力的影响 选择体重为7.73±0.03g的健康建鲤1050尾,分成七个处理,每个处理设3个重复,每个重复50尾,分别饲喂Trp水平为0.11%、0.17%、0.25%、0.38%、0.49%、0.60%和0.69%的纯合饲粮60d,探索色氨酸对幼建鲤生长性能、体成分沉积以及血清、肝胰脏和肌肉中谷草转氨酶和谷丙转氨酶活力的影响。结果表明:色氨酸对幼建鲤生长性能、体成分沉积和肝胰脏、肌肉、血清的GOT、GPT活力以及血浆氨含量均有极显著(P0.01)或显著(P0.05)影响,并呈开口向上或开口向下的抛物线模型,其顶点多为0.38%的色氨酸水平。当色氨酸水平从0.11%升高到0.38%时,特异性增长率(SGR)、采食量、体蛋白含量、蛋白质沉积率、蛋白质效率、体脂肪含量、脂肪沉积率、灰分沉积率、肝胰脏和肌肉的GOT和GPT活力均极显著(P0.01)或显著(P0.05)升高,到0.38%时最高,随后均极显著(P0.01)或显著(P0.05)降低。当色氨酸水平从0.11%升高到0.38%时,饵料系数、体水分含量、体灰分含量、血氨含量、血清GOT和GPT活力均极显著(P0.01)或显著(P0.05)降低,到0.38%时最低,随后均极显著(P0.01)或显著(P0.05)升高。进一步相关分析发现增重与蛋白质沉积率、脂肪沉积率、灰分沉积率和采食量呈现极显著(P0.01)或显著(P0.05)的正相关关系;饵料系数与增重、蛋白质沉积率和脂肪沉积率呈现极显著(P0.01)的负相关。结果说明:Trp能促进幼建鲤的生长,提高体蛋白和脂肪的沉积能力,增强肝胰脏和肌肉中的氨基酸代谢强度;以生长速度为标识确定的10-40g的幼建鲤Trp需要量为0.35%或1.09/100g蛋白质。 3 Trp对幼建鲤肝胰脏和肠道生长发育、消化酶活力和肠道刷状缘相关酶活力的影响 选择体重为7.73±0.03g的健康建鲤1050尾,分成七个处理,每个处理设3个重复,每个重复50尾,分别饲喂Trp水平为0.11%、0.17%、0.25%、0.38%、0.49%、0.60%、0.69%的纯合饲料60天。结果表明:当色氨酸水平从0.11%升高到0.38%时,幼建鲤肝胰脏重量、肝体指数、肝胰脏蛋白含量、肠重、肠长、肠道蛋白含量、肠体指数和肠长指数以及前、中、后肠的皱襞高度、肝胰脏和肠道胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力,全肠肌酸激酶活力,前、中、后肠的碱性磷酸酶(AKP)、Na+,K+-ATP酶和γ-GT酶活力均极显著(P0.01)或显著(P0.05)升高,到0.38%时最高,随后极显著(P0.01)或显著(P0.05)下降。肠道糜蛋白酶活力在0.25%组最高(P0.05)。色氨酸对肝胰脏糜蛋白酶活力无显著影响(P0.05)。进一步相关分析发现蛋白沉积率与肠胰蛋白酶、肝胰脏胰蛋白酶、肝胰GOT、肌肉GOT、肝胰GPT和肌肉GPT呈现极显著(P0.01)或显著(P0.05)的正相关关系;脂肪沉积率与肝胰脏脂肪酶呈现显著(P0.05)的正线性相关;饵料系数与肝胰脏胰蛋白酶和脂肪酶、肠道胰蛋白酶和糜蛋白酶、前肠和后肠Na+,K+-ATP、前中后肠AKP和γ-GT、CK活力呈现极显著(P0.01)或显著(P0.05)的线性负相关。本试验结果表明:Trp可以提高幼建鲤消化吸收能力。消化吸收能力的提高与Trp促进肝胰脏和肠道生长发育,提高蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶分泌能力,增加肠道吸收面积和肠道上皮吸收能力有关。 4 Trp对幼建鲤肠道菌群、特异性免疫和非特异性免疫能力的影响 选择体重为7.73±0.03g的健康建鲤1050尾,分成七个处理,每个处理设3个重复,每个重复50尾,分别饲喂Trp水平为0.11%、0.17%、0.25%、0.38%、0.49%、0.60%、0.69%的纯合饲料,进行为期60天的生长实验,测定肠道菌群、红白细胞数量和免疫器官重量。生长实验结束后用嗜水气单胞菌攻毒17天,考察色氨酸对幼建鲤疾病抵抗力和免疫功能的影响。结果表明:当色氨酸水平从0.11%升高到0.25%,肠道乳酸杆菌极显著(P0.01)或显著(P0.05)提高,0.25%组和0.38%组差异不显著(P0.05),随后极显著(P0.01)或显著(P0.05)降低;肠道大肠杆菌呈现刚好相反的模型。色氨酸对鲤鱼肠道嗜水气单胞菌无显著影响(P0.05)。色氨酸极显著(P0.01)或显著(P0.05)提高了头肾、后肾、脾脏重量和相应的指数,当色氨酸水平达到0.38%时达到最大,随着色氨酸水平的再升高,头肾、后肾、脾脏重量和相应的指数极显著(P0.01)或显著(P0.05)降低。当色氨酸水平从0.11%升高到0.38%时,红细胞和白细胞数量均极显著(P0.01)或显著(P0.05)升高,到0.38%时最高,随后均极显著(P0.01)或显著(P0.05)降低。当色氨酸水平从0.11%升高到0.25%时,攻毒后成活率极显著升高(P0.01),0.25%-0.49%处于平台值(P0.05),随后均显著(P0.05)降低。当色氨酸水平从0.11%升高到0.49%时,血清IgM含量极显著(P0.01)或显著(P0.05)升高,随后极显著降低(P0.01)。血清抗嗜水气单胞菌效价随着色氨酸水平升高到0.38%而增加,随后逐渐下降(P0.05)。当色氨酸水平从0.11%升高到0.38%时,白细胞吞噬率、血清补体C3、C4、溶菌酶活力、酸性磷酸酶活力和总铁结合力均极显著(P0.01)或显著(P0.05)升高,随后均极显著(P0.01)或显著(P0.05)降低,但对血清凝集素效价无显著影响(P0.05)。相关分析发现,攻毒后成活率与免疫器官重量、抗体效价、白细胞吞噬率、ACP、C3、C4和总铁结合力呈现极显著(P0.01)或显著(P0.05)的线性相关;白细胞吞噬率与红白细胞数量和补体C3、C4含量呈现极显著(P0.01)或显著(P0.05)的正线性相关;红白细胞数量与免疫器官重量呈现极显著(P0.01)或显著(P0.05)的线性相关关系。本试验结果表明:Trp能提高幼建鲤的疾病抵抗能力以及改善其肠道微生态平衡。疾病抵抗能力的提高与Trp提高特异性免疫和非特异性免疫能力有关。非特异性免疫能力的提高与Trp提高其对病原菌的粘附调理、抑菌、溶菌能力有关。 5 Trp对幼建鲤前、中、后肠和肌肉中TOR mRNA含量的影响 选择体重为7.73±0.03g的健康建鲤1050尾,分成七个处理,每个处理设3个重复,每个重复50尾,分别饲喂Trp水平为0.11%、0.17%、0.25%、0.38%、0.49%、0.60%和0.69%的纯合饲料60天,研究Trp对幼建鲤肠道和肌肉TOR mRNA表达量的影响。结果发现:鲤鱼前肠和中肠的TOR mRNA表达量随色氨酸水平升高而降低,随后逐渐升高,当色氨酸水平为0.49%和0.38%时,TOR mRNA表达量分别为最低(P0.05)。当色氨酸水平从0.11%到0.17%时,后肠TORmRNA表达量显著降低(P0.05),色氨酸水平为0.17%和0.25%时,其mRNA表达量最低,随后逐渐上升,到最高水平(0.69%)时最大(P0.05)。肌肉TORmRNA的表达量在色氨酸中间水平(0.38%和0.49%)最低(P0.05),色氨酸低水平(0.11%)和高水平(0.60%和0.69%)表达量最高(P0.05)。综合结果说明:日粮Trp缺乏或过量均提高幼建鲤前、中、后肠和肌肉中的TOR基因表达,但Trp在适宜水平时降低,其影响机制有待进一步研究。 6 Trp对幼建鲤肠上皮细胞增殖分化的影响 试验分为6个处理,每个处理设4个重复,选择体重为80g左右的健康鲤鱼进行肠道上皮细胞接种培养后分别添加色氨酸浓度为0、16、36、66、96和126mg/L的DMEM培养液继续培养96h,收集培养液和细胞,对相关指标进行分析测试。结果表明:随着色氨酸浓度上升到36mg/L-66mg/L时,观察发现贴壁生长细胞数量明显增多,并形成大的细胞集落和成片的单层细胞,随后细胞数量有所下降。色氨酸水平从0到36mg/L时,鲤鱼肠上皮细胞的MTTOD值显著上升(P0.05),36mg/L和66mg/L差异不显著(P0.05),随后逐渐下降(P0.05)。鲤鱼肠上皮细胞蛋白含量、谷草转氨酶活力、谷丙转氨酶活力、碱性磷酸酶活力、Na+,K+-ATP活力随色氨酸水平升高而显著升高(P0.05),当色氨酸水平达到36,36,66,36和16mg/L时分别达到最大,随后逐渐降低(P0.05)。培养液氨含量和乳酸脱氢酶活力随色氨酸水平升高而显著降低(P0.05),当色氨酸水平达到96和66mg/L时分别达到最低,随后逐渐降升高(P0.05)。结果表明:色氨酸促进了鲤鱼肠道上皮细胞的增殖和分化,保证了功能正常。 7 Trp对幼建鲤肠细胞蛋白合成和TOR基因表达的影响 本研究进行了3小试验。(1)试验设2个处理组(0mg/L和36mg/L Trp),每个处理8个重复,培养时间为240min,研究Trp对肠细胞蛋白质合成的影响。(2)试验设5个处理组,每个处理6个重复,分别于15min,30min,100min,170min和240min采样,研究36mg/L Trp对肠细胞TOR基因表达影响的时间效应。(3)试验设2个处理组(0mg/L和36mg/L Trp),每个处理8个重复,培养时间100min,研究36mg/L Trp对肠细胞TOR基因表达的影响。结果表明:(1)36mg/L色氨酸处理组细胞蛋白质合成率显著高于未添加色氨酸的对照组(0mg/LTrp)(P0.05)。(2)30min时,TORmRNA的表达量显著低于15min,并达到最低(P0.05),随后逐渐升高,在170min和240min时,达到最高(P0.05)。(3)36mg/L组TOR mRNA表达量显著高于未添加色氨酸的对照组(0mg/LTrp)(P0.05)。结果说明:Trp可促进鲤鱼肠细胞蛋白质合成,同时影响了蛋白质合成信号调控分子TOR的表达。 综上所述:20-80g的幼建鲤随体重增加,胰腺分泌胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的能力增加,其分泌能力的增加与胰腺的发育逐步完善有关;肠道吸收能力随幼建鲤体重增加逐步提高,其吸收能力的提高与肠道的发育逐步完善有关。Trp能促进幼建鲤的生长,提高了体蛋白和脂肪的沉积能力;Trp通过促进肝胰脏和肠道生长发育,提高蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶分泌能力,增加肠道吸收面积和肠道上皮吸收能力有关;Trp影响肌肉和肠道蛋白质合成信号调控分子TOR mRNA的表达量,缺乏和过量表达量都升高;Trp促进了鲤鱼肠道细胞生长发育,保证了功能正常,促进鲤鱼肠细胞蛋白质合成,但蛋白质合成信号调控分子TOR的表达降低。Trp提高了幼建鲤的疾病抵抗能力。疾病抵抗能力的提高与Trp提高特异性免疫、非特异性免疫能力以及改善了其肠道微生态平衡有关。非特异性免疫能力的提高与Trp提高其对病原菌的粘附调理、抑菌、溶菌能力有关。以生长速度为标识确定的10-40g的幼建鲤Trp需要量为0.35%或1.09/100g蛋白质。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S963

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