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《四川农业大学》 2010年
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喹诺酮药物对异育银鲫P450酶系的影响及3A亚型克隆

胡晓  
【摘要】: 本论文的研究内容分为两部分:第一部分为2种喹诺酮药物对异育银鲫细胞色素P450的影响。氟甲喹研究其对不同组织中P450各亚型的影响变化;恩诺沙星研究其对P450影响的时间与剂量关系。两种药物试验都从酶活、蛋白和mRNA三个水平结合体外试验进行研究;第二部分为异育银鲫细胞色素P450 3A亚型的克隆及组织表达分布。采用RACE技术获取了全长cDNA序列,运用RT-PCR方法研究了CYP3A mRNA在异育银鲫各组织中的分布。 1.氟甲喹与恩诺沙星对异育银鲫细胞色素P450的影响 异育银鲫以剂量35mg/kg腹腔注射氟甲喹24h后,肝微粒体的7-乙氧基异吩唑酮-O-脱乙基酶(EROD)活性为54.33±5.42 pmol/mg-min,显著高于对照组(34.00±5.87pmol/mg-min)(p0.01),而红霉素-N-脱甲基酶(ERND)(177.98±32.94 pmol/mg-min)、氨基比林-N-脱甲基酶(APD) (934.40±173.29 pmol/mg-min)及7-乙氧基香豆素-O-脱乙基酶(ECOD) (9.84±3.29 pmol/mg-min)与对照组(分别为140.90±22.89pmol/mg-min、850.71±229.68 pmol/mg·min和8.93±2.77 pmol/mg-min)相比无显著性差异。Western blotting表明,试验组肝脏中CYP1A蛋白含量显著高于对照组(2倍),与酶活(EROD)相符合;肾、肠中没有检测到特异条带。半定量RT-PCR结果显示,CYP1A mRNA在肝、肾和肠均有表达,但试验组与对照组并无显著差异。体外试验中,EROD活性与氟甲喹浓度、时间无依赖关系。综上推测,氟甲喹对异育银鲫肝CYP1A的诱导发生在翻译后水平,是加强蛋白的稳定性。 恩诺沙星10mg/kg腹腔注射对鲫鱼CYP3A依赖的红霉素-N-脱甲基酶(ERND)有显著抑制作用(40%),48h达到最低值(306.93±19.30 pmol/mg-min),8d恢复到给药前水平(496.76±46.04 pmol/mg-min)。对于CYP1A,7-乙氧基异吩唑酮氧脱乙基酶(EROD)活性在24h即达到最大抑制(对照组85.79±6.86 pmol/mg-min/给药组71.50±7.38 pmol/mg-min),但抑制程度不及CYP3A。恩诺沙星使CYP1A蛋白含量随时间增加,而CYP3A蛋白受抑制趋势与其酶活变化相似;半定量RT-PCR显示CYP1A mRNA与CYP3A mRNA在肝脏中的表达与EROD, ERND抑制曲线相符合,分别在24h,48h达到最低值(60%,64%),但8d后均未恢复到对照水平。不同剂量的恩诺沙星3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg、60mg/kg)腹腔给药24h后取样结果显示,EROD、ERND活性随给药剂量的增大而降低,最大抑制率分别为48%、52%。Western blotting结果表明,CYP1A蛋白含量在3mg/kg、10mg/kg恩诺沙星组中变化不大,但在30mg/kg、60mg/kg组中下降了约50%。CYP3A蛋白含量在不同剂量的恩诺沙星给药后相比对照组无明显变化。CYP1A mRNA在肝脏中的表达与EROD抑制曲线相符合,而CYP3A mRNA表达水平无明显变化。体外试验中,恩诺沙星显示出对CYP3A蛋白的机理性抑制,而对代表CYP1A的EROD活性则没有影响。综上结果说明恩诺沙星对CYP1A的抑制发生在体内水平,而对CYP3A的抑制是体内与体外水平综合的结果,在体外还存在对蛋白的机理性抑制。 2.异育银鲫细胞色素P450 3A亚型的克隆及组织表达分布 本试验根据4种鱼类CYP3A同源性序列设计兼并引物,采用RT-PCR和RACE的方法,得到了异育银鲫CYP3A全长cDNA序列。基因全长1770bp,5’端非编码区30bp,3’端非编码区195bp,开放阅读框1545bp,编码515个氨基酸。序列分析表明异育银鲫CYP3A氨基酸序列与人、小鼠、大鼠的相似性为73%-75%,与稀有鮈鲫的相似性为92%。进化树分析显示异育银鲫CYP3A氨基酸序列与鲤科鱼类同源性较高,而与其它物种遗传距离较远。利用半定量RT-PCR方法研究CYP3A在异育银鲫各组织中的表达分布,结果表明CYP3A在肝脏,肠中表达量最高,肾、鳃中次之,其余组织表达较低。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S943

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【引证文献】
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