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《四川农业大学》 2010年
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黄鳝肠道cDNA文库构建、EST分析及抗菌肽基因的原核表达

唐勇  
【摘要】: 黄鳝(Monopterus albus)是广泛分布于我国南北水域的名优水产养殖品种之一。本文运用分子生物学、生物信息学、基因工程等技术与方法,通过构建肠道cDNA文库对黄鳝肠道内营养代谢、免疫相关功能基因进行了一些初步分析与探讨;并对黄鳝抗菌肽hepcidin的原核表达进行了初步研究。 首次成功构建了黄鳝全肠未剪切cDNA文库。经检测,文库的库容量达到1.46×107cfu,重组阳性克隆率为96.88%,平均插入片段约2.11kb,符合高质量文库要求。随机从文库中挑取1056个阳性克隆进行5’单向测序,去除载体序列与低质量序列后获得了906条高质量的EST序列,平均长度为812bp,并提交到dbEST数据库(GenBank accession number:GW584265-GW585168)。通过拼接与组装,共获得762条有效的一致序列,其中61个重叠群包含2条以上的EST,其余701个仅含有一条EST。运用NCBI BLAST对序列进行比对,SeqGO进行功能注释。鉴定出与营养相关的EST共有5类,59种:蛋白质氨基酸代谢类25种,碳水化合物代谢类13种,脂类代谢类5种,能量代谢类12种,无机离子代谢类4种;发现免疫相关基因共73个,首次证实了肠道内存在大量与黄鳝免疫功能相关的基因,其中包括几丁质酶、溶菌酶、凝集素、抗氧化酶类、主要组织相容性复合体(MHC)、热休克蛋白(HSP)、IgM等;在黄鳝肠道中还发现了嗜酸性粒细胞趋化因子(ECC),这是该基因首次在硬骨鱼类中得到证实。 应用PCR技术从文库中筛选出了黄鳝抗菌肽基因hepcidin(GenBank accession number:GU997139),应用在线分析软件,对筛选的抗菌肽基因hepcidin进行了序列分析,发现其ORF区域为273bp,编码90个氨基酸残基的阳离子抗菌肽,分子量为10236Da。进一步分析抗菌肽蛋白质序列,包含24个氨基酸的信号肽和40个氨基酸的前域部分,成熟肽为26肽,结构预测显示其属于β-折叠类抗菌肽,包含有hepcidin类抗菌肽典型的8个半胱氨酸结构,形成4对二硫键。同源比对发现黄鳝hepcidin与多种动物的hepcidin序列高度同源,与大黄鱼和黑鲈hepcidin的相似性高达81%。 利用基因工程技术,首次对黄鳝hepcidin基因在原核细胞中表达进行了初步研究。分别构建了pET22b(+)重组表达载体,发现黄鳝抗菌肽hepcidin基因构建的pET22b(+)表达载体在原核细胞中不能表达。通过pET43. la(+)构建黄鳝hepcidin基因融合表达载体,转化到BL21(DE3)pLysS, BL21Star(DE3)pLysS和BL21-CondonPlus (DE3)-RIPL三种表达菌株中进行诱导表达,重组pET43. la(+)-hepcidin在原核细胞中均无明显表达。在pET32a(+)载体中分别构建黄鳝hepcidin全长编码序列(pET32a(+)-hepcidin)和去信号肽序列(pET32a(+)-nhepcidin)重组表达载体,转化到BL21(DE3)pLysS, BL21Star(DE3)pLysS, BL21-CondonPlus (DE3)-RIPL三种不同的表达菌株中进行诱导表达,发现含有信号肽的pET32a(+)-hepcidin重组表达载体在三种菌株中均不能正常表达;而不含信号肽的pET32a(+)-nhepcidin重组表达载体在BL21-CondonPlus (DE3)-RIPL中能高效表达。通过优化诱导表达条件,获得黄鳝抗菌肽pET32a(+)-nhepcidin重组载体在BL21-CondonPlus (DE3)-RIPL中的最佳表达条件为菌液浓度(OD600)0.5-0.7、温度为37℃、IPTG浓度0.5mM、诱导时间4-6h;鉴定发现pET32a (+)-nhepcidin在BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL表达菌株中为可溶表达重组蛋白。 本试验首次成功构建了黄鳝肠道未剪切cDNA文库,发现了许多与肠道营养代谢和抗病相关的EST序列,为黄鳝肠道功能基因的研究奠定了分子基础;黄鳝肠道中抗菌肽hepcidin的发现不仅为黄鳝功能基因研究拓宽了道路,而且对开发用于黄鳝养殖的新型抗病药物提供了重要的候选物和参考依据。获得的研究资料将为后续研究打下基础。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S966.4

【引证文献】
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【参考文献】
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【共引文献】
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1 张彦娇;盐度和温度对大菱鲆非特异性免疫力的影响及淡水螯虾相关免疫因子的研究[D];中国海洋大学;2010年
2 张琴;刺参(Apostichopus japonicus Selenka)高效免疫增强剂的筛选与应用[D];中国海洋大学;2010年
3 王孟强;栉孔扇贝(Chlamys farreri) Toll样受体信号通路免疫功能研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2010年
4 丁鉴锋;皱纹盘鲍溶菌酶及两种蛋白酶抑制因子的克隆与表达[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2011年
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9 汪家琦;鸡蛋中主要生物活性物质的制备及应用性质的研究[D];东北农业大学;2000年
10 王冰山;Germin基因的克隆和人溶菌酶基因的合成及其在烟草和油菜中的表达[D];中国农业科学院;2000年
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5 杨洪娜;利用新苊并杂环类小分子探测Bcl-2和Mcl-1蛋白的BH3域三维尺度[D];大连理工大学;2011年
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10 李金海;酸性成纤维细胞生长因子对人脐血内皮祖细胞影响的实验研究[D];福建医科大学;2011年
【同被引文献】
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2 李思明;维生素D_3对丝毛鸡β-防御素诱导表达及生长免疫性能的影响[D];四川农业大学;2009年
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1 张桐;饲料中添加不同水平维生素D_3对松浦镜鲤幼鱼影响的研究[D];上海海洋大学;2011年
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【二级引证文献】
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1 刘洪展;养殖仿刺参对环境因子和病原的免疫应答及抗病分子机理[D];中国海洋大学;2013年
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