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《四川农业大学》 2010年
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魏氏梭菌α毒素基因的克隆表达及间接ELISA方法的初步研究

宋宇  
【摘要】: 魏氏梭菌病是危害养兔业的重要疾病。某养兔场发生一种以急性黑色水样腹泻或排带血的胶冻样粪便、盲肠出血、胃黏膜出血为主要特征的传染病。通过病原菌的分离培养、形态染色观察、生化鉴定和半套式PCR反应,分离出一株魏氏梭菌。通过药物敏感实验筛选出了敏感药物。实验结果为该病的正确防控措施的制定提供了参考。 对GenBank发表的魏氏梭菌α毒素基因的氨基酸序列进行了二级结构、疏水性、抗原决定簇、跨膜区以及抗原性分析,在此基础上,对α毒素基因130~966 nt位的837 bp长的适合原核表达的区域进行PCR扩增、克隆、核酸序列测定和生物信息学分析。序列测定结果表明:该段序列全长837 bp。核酸序列同源性分析表明:该序列与GenBank中的其他魏氏梭菌菌株的α毒素基因同源性高达99%。生物信息学分析表明:该基因编码的蛋白具有亲水性,没有跨膜区,共有11个抗原决定簇,在整个序列存在较强的抗原性。 然后将目的片段正确插入原核表达载体PET-32a(+)的EcoRⅠ和Hind III位点间,成功构建了重组表达质粒PET-32a (+)-a,重组表达质粒PET-32a(+)-α转化表达宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导,表达出大小为53KD的重组蛋白。对重组蛋白进行了可溶性与不可溶性分析,结果表明表达产物主要以不溶性包涵体的形式存在。同时对诱导温度、诱导时间及IPTG浓度进行了优化,确定了最佳表达条件。 以纯化的重组蛋白为包被抗原(重组蛋白量为0.241mg/ml,A260=0.340),建立了检测魏氏梭菌α毒素抗体的间接ELISA方法;结果表明:当OD450≥0.30时即判定为阳性,当OD4500.30时即判定为阴性。该方法可用于抗魏氏梭菌α毒素抗体的检测。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S858.291

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【参考文献】
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