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《重庆医科大学》 2011年
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p38MAPK信号通路在低强度脉冲超声波诱导人牙周膜细胞成骨分化中作用探讨

任蕾西  
【摘要】:人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)是牙周组织的主要细胞成分,含有不同分化方向和阶段的异质性细胞群体,有合成胶原,吞噬经酶降解的陈旧胶原纤维,形成牙骨质等作用,对牙周组织起作修复和保护的作用,也是牙周组织再生的细胞学基础。 研究表明[1-3]低强度脉冲超声(low intensity pulsed ultrasound ,LIPUS)的刺激可引起细胞膜结构变化,改变K~+等离子的通透性、激活第二信使、影响细胞因子的表达,从而引起骨折愈合的链式反应;可以促进局部血流及淋巴的循环,促进生长因子等骨折愈合关键物质如细胞活素等的运输加强,刺激细胞增殖及细胞外基质合成。 p38MAPK是MAPK家族的重要成员之一,近年来研究发现p38MAPK在骨的代谢中也发挥着重要的作用。PDLCs与成骨细胞具有一定的相似性,我们推测p38MAPK可能参与了PDLCs的分化调控,同时推测p38MAPK也可能参与了LIPUS诱导的PDLCs成骨分化。 因此,本研究在p38MAPK在LIPUS诱导hPDLCs成骨分化的作用机制的探讨具有重要意义。 目的: 1、体外培养hPDLCs。 2、观察SB203580阻断干扰下,LIPUS对hPDLCs合成分泌碱性磷酸酶、骨钙素及钙盐的影响。 3、连续动态观察LIPUS对hPDLCs中p38MAPK活性的影响,为揭示LIPUS对 4、观察SB203580对p38MAPK阻断干扰下,LIPUS对p38MAPK活性的影响,为揭示LIPUS对hPDLCs成骨分化的具体机制提供实验依据。 方法: 1、应用组织块法进行hPDLCs的体外培养,并对其进行形态学的观察、来源鉴定、绘制细胞生长曲线。 2、取第五代人PDLCs接种于六孔板,实验组加入浓度为10μl/L p38MAPK阻断剂SB203580(溶剂为DMSO),对照组、空白组加入浓度为10μl/L DMSO,放入CO_2培养箱培养;置实验组和对照组于六通道LIPUS换能器上进行辐照,20min/d;空白组置于六通道LIPUS换能器进行20min/d、不开电源的假辐照。第11天对各组进行成骨分化期标志蛋白ALP的检测。第15天应用放射免疫法检测检测上清液中骨钙素的含量。第21天进行茜素红染色,检测钙盐的分泌情况。 3、取第五代人PDLCs,消化后接种于六孔板,接种密度为1*104个/ml,1.5ml/孔,设定实验组和对照组,每组3孔细胞,镜下见细胞汇合约60%,饥饿细胞24小时, LIPUS分别辐照0min、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min、6h,收集需要检测的细胞,采用western-blot检测磷酸化p38 MAPK(p-p38)及总p38(p38)。4、取第五代人PDLCs,每组3孔细胞,一组加入10μl/L SB203580,另一组加入浓度为10μl/L的DMSO以排除SB203580溶剂DMSO对实验的干扰,饥饿细胞24小时,LIPUS进行辐照,辐照时间选用LIPUS连续辐照时,p-p38强度最高的时间点。收集需要检测的细胞,采用western blotting检测磷酸化p38及总p38。 结果: 1、以90 mW/cm~2、20min/d,LIPUS连续辐照11天发现,各细胞组上清液和裂解液中ALP含量有差别,且具有统计学意义(F裂解=1207,F上清=334;p0.05)。组间比较发现,实验组中裂解液中ALP含量少于对照组(t=54.18,P0.05),对照组中裂解液ALP含量较空白组多(t=24.47,P0.05);实验组中上清液中ALP含量少于对照组(t=45.08,P0.05),对照组中上清液ALP含量较空白组多(t=22.98,P0.05)。 2、以90 mW/cm~2-20min/d,LIPUS连续辐照15天,分析后发现各细胞组分泌的OC有差别,且差别具有统计学意义(F=28.2;p0.05)。采用自身配对t检验进行统计学处理后发现,实验组中OC含量少于对照组(t=7.48,P0.05),对照组中OC含量较空白组多(t=4.31,P0.05)。 3、以90 mW/cm~2、20min/d,LIPUS连续辐照21天,倒置相差显微镜观察,对照组和空白组可见多个被茜素红染色成红色的大小不等的矿化结节,形成较为密集;实验组矿化结节数量极少(图4)。各细胞组间钙结节数量有差别( F=46.458,P0.05)。钙结节计数结果显示,LIPUS诱导的对照组与无LUPUS诱导的空白组相比钙结节数量增多(t=8.9918, P0.05),加入阻断剂的实验组在LIPUS的成骨诱导下与对照组相比,钙结节数量明显减少(t=3.2149,P0.05)。 4、以90 mW/cm~2、20min/d,LIPUS连续辐照处理0min、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min、6h,进行总p38和p-p38检测,发现p-p38灰度值从5min开始增加,30min时p-p38灰度值达峰值,60min时开始下降,6h最低(F=170.01,p0.05)。而总p38灰度值的变化无统计学意义(F=0.748,p0.05)。 5、以90 mW/cm~2-20min/d,LIPUS连续辐照30 min发现(时间点的选择参照2.1实验结果),加入10μl/L SB203580的实验组,p-p38灰度值低于对照组(F=2208.54,P0.05)。而总p38灰度值的变化两组无统计学意义(F=0.75,P0.05)。 结论: 1、以90 mW/cm~2、20min/d,LIPUS连续辐照处理0min、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min、6h,进行总p38和p-p38检测,发现30min时p-p38灰度值达峰值。此时间参数为后续实验提供参考。 2、p38MAPK可能参与了LIPUS诱导下的hPDLCs骨向分化,但其具体的作用机制尚需进一步研究。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R781.42

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