收藏本站
《重庆医科大学》 2011年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

尿酸酶的聚乙二醇修饰及其成药性的初步评价

张纯  
【摘要】:大肠杆菌重组表达苛求芽孢杆菌(ATCC29604)尿酸酶,为同源四聚体,序列中每条多肽链含有17个氨基,经两次DEAE-cellulose柱纯化后比活性达到6.0 IU/mg。在大鼠体内的代谢半衰期只有10-15min,并显示出较强的免疫原性。聚乙二醇修饰是提高蛋白质成药性的主要手段。本文优化单甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰此重组表达尿酸酶的条件,并初步评价mPEG修饰尿酸酶的成药性。 1聚乙二醇修饰试剂的制备 结合尿酸酶蛋白的结构特点,用两类方法制备了数种主要以尿酸酶蛋白表面的游离氨基作为修饰目标的修饰试剂。一类方法用单甲氧基聚乙二醇5000(mPEG5k)和350(mPEG350)先与丁二酸酐在四氢呋喃中反应,生成聚乙二醇丁二酸单酯后再与N-羟基琥珀酰亚胺经DCC脱水,制得单甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亚胺酯(SS-mPEG5k ,SS-mPEG350),其中SS-mPEG5k收率为60-75%,SS-mPEG350收率约56%。另一类方法用mPEG5k先与三氯甲基碳酸酯在二氯甲烷中反应生成单甲氧基聚乙二醇碳酰氯,再与N-羟基琥珀酰亚胺反应得琥珀酰亚胺的单甲氧基聚乙二醇碳酸酯(SC-mPEG5k),收率约87%。为比较不同体积N-羟基琥珀酰亚胺酯修饰氨基的差异,同时用乙酸与N-羟基琥珀酰亚胺在DCC作用下制得其乙酸酯(Ac-NHS),收率约90%。通过与萘替乙二胺衍生检测活化酯同氨基的反应活性并估算其含量。 2聚乙二醇修饰尿酸酶的条件优化 TNBS测定氨基,考察聚乙二醇修饰剂与尿酸酶多肽链的数量(摩尔比)、尿酸酶氨基的修饰度等对修饰尿酸酶剩余活性的关系。 摩尔比在0~100之间时,尿酸酶氨基修饰度与修饰剂用量呈良好线性关系(y=0.67·X―4.96, R~2=0.99);在摩尔比接近200时,修饰度达到80%;摩尔比在200~500间修饰度平缓地接近85%。随着修饰度增加,尿酸酶活性持续下降至原活性的17%。 比较SS-mPEG_5k,SS-mPEG_350和乙酸琥珀酰亚胺酯衍生物对修饰产物活性的影响,发现SS-mPEG_5k最大修饰度达到75%且对应剩余活性为60~70%,SS-mPEG350最大修饰度达到86%且对应剩余活性为23%,乙酸琥珀酰亚胺酯最大修饰度达到94%对应剩余活性为10%。 两种尿酸酶抑制剂氧嗪酸和黄嘌呤,及其底物尿酸等配体都可显著提高SC-mPEG_5k修饰后尿酸酶活性保留比例。在摩尔比为200的修饰剂用量时,无配体存在下尿酸酶修饰度达到80%但只保留20-30%活性。30μM氧嗪酸可使尿酸酶修饰后保留活性达到70%、150μM黄嘌呤可使尿酸酶修饰后保留活性达到59%、(初始浓度)500μM尿酸可使尿酸酶修饰后保留活性达到53%。 3 mPEG5k修饰尿酸酶成药性的初步评价 mPEG5k修饰尿酸酶的pH、Mg~2+效应方面与未修饰尿酸酶相似,而其热稳定性以及抗蛋白酶水解能力有显著改善。用尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾(Ki≦3μM)按每天0.20mg/g的剂量对SD大鼠腹腔注射持续4-6周成功建立高尿酸血症大鼠模型,大鼠血浆尿酸水平持续保持在0.42 mM以上,而体内尿酸酶抑制剂总量(氧嗪酸当量)也维持在较高的水平,对尿酸酶药效学的评价产生显著的干扰。因此,我们设计了体外降尿酸能力与体内代谢半衰期考察相结合的方法综合评价mPEG_5k修饰尿酸酶的药效学和药代学性质。mPEG_5k修饰尿酸酶与未修饰尿酸酶在体外血浆中都显示出较好的降尿酸能力;未修饰尿酸酶在健康大鼠体内活性衰减半衰期hf≈12min,mPEG修饰尿酸酶代谢半衰期约20小时。禽类体内缺乏内源性尿酸酶。mPEG修饰尿酸酶在鸡体内有更长的活性衰减半衰期且可长时间维持体内血浆尿酸在较低水平。未修饰尿酸酶有很强免疫原性,在家兔体内抗尿酸酶IgG抗体滴度达到1:781250以上;大鼠体内,mPEG_5k修饰尿酸酶的原有抗原反应活性大幅下降至5%以下,与兔抗尿酸酶抗体的抗原反应活性低于未修饰尿酸酶的10%,且出现了新的主要是针对mPEG的免疫原性。 综上所述,修饰剂结构性质、用量影响尿酸酶修饰效果,尿酸酶抑制剂对修饰尿酸酶的活性保留有显著影响,mPEG_5k修饰尿酸酶的成药性有一定的提高。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R914

手机知网App
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前5条
1 吴洁,胡卓逸,吕小斌,刘景晶;聚乙二醇对溶菌酶和粒细胞集落刺激因子的初步化学修饰[J];中国生化药物杂志;2004年01期
2 胡永祥,牛津梁,张文博,高林;聚乙二醇修饰药物技术的研究进展[J];中国生化药物杂志;2004年06期
3 魏练平,王荣海,戎隆富,宋礼华;聚乙二醇化重组人生长激素的性质及活性[J];中国生物制品学杂志;2005年02期
4 吴洁,刘景晶,胡卓逸;蛋白质药物的聚乙二醇修饰[J];药学进展;2002年03期
5 武霞;冯军;赵文杰;;降纤酶的聚乙二醇修饰及产物的纯化研究[J];中国医药工业杂志;2006年04期
中国重要会议论文全文数据库 前2条
1 腾莉;刘金锋;高德民;谭海宁;刘玉红;王凤山;;低分子壳聚糖对超氧化物歧化酶的化学修饰研究[A];2007年全国生化与生物技术药物学术年会论文集[C];2007年
2 赵婷;王凤山;王秀云;;蛋白质和多肽的PEG定点修饰研究进展[A];2007年全国生化与生物技术药物学术年会论文集[C];2007年
中国博士学位论文全文数据库 前5条
1 王捷熙;红细胞血型抗原的化学修饰[D];中国人民解放军军事医学科学院;2003年
2 黄涛;化学修饰胰岛素的制备、表征和生物活性[D];华中科技大学;2004年
3 潘红春;重组蛋白hCH-2的PEG修饰及其初步特性研究[D];重庆大学;2006年
4 李媛媛;超嗜热古菌Pyrococcus horikoshii OT3组蛋白介导野生型p53基因治疗鼻咽癌的实验研究[D];吉林大学;2007年
5 任勇;聚环氧乙烷(PEO)类聚合物的合成、表征及应用[D];复旦大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 徐华;甲氧基聚乙二醇修饰人红细胞稀有血型抗原的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年
2 李立立;化学修饰改造RhD(+)稀有血型[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年
3 熊剑;聚乙二醇衍生物的合成及其几种修饰酶性能的研究[D];南京理工大学;2004年
4 张晓芳;聚乙二醇胸腺肽α1和胸腺肽α1的药理学比较观察[D];第二军医大学;2005年
5 王俊才;重组人生长激素聚乙二醇化修饰研究[D];吉林大学;2005年
6 武霞;聚乙二醇修饰降纤酶的研究[D];上海医药工业研究院;2005年
7 浦鸣;生物功能化梳状聚乙二醇改性组织工程材料表面的研究[D];浙江大学;2006年
8 胡永祥;聚乙二醇修饰牛血红蛋白作为红细胞代用品的初步研究[D];天津大学;2005年
9 周维;聚乙二醇衍生物的合成和特性研究[D];浙江大学;2006年
10 廉洁;聚乙二醇对超氧化物歧化酶修饰技术及产物研究[D];重庆大学;2006年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前5条
1 赵利娜,廖飞,赵运胜;用线性动力学方法考察黄嘌呤对尿酸酶的抑制作用[J];第四军医大学学报;2005年15期
2 廖飞,李甲初,康格非,曾昭淳,左渝萍;Measurement of mouse liver glutathione S-transferase activity by the integrated method[J];Journal of Medical Colleges of PLA;2003年05期
3 廖飞;赵运胜;赵利娜;陶佳;朱小云;王咏梅;左渝平;;Kinetic method for enzymatic analysis by predicting background with uricase reaction as model[J];Journal of Medical Colleges of PLA;2005年06期
4 于青琳;芽胞杆菌尿酸酶的制备及鉴定[J];临床检验杂志;1994年03期
5 赵利娜;陶佳;赵运胜;廖飞;;分析谷胱甘肽-S-转硫酶的产物抑制反应过程测定还原型谷胱甘肽[J];西安交通大学学报(医学版);2006年03期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 才蕾;高向东;朱姝;王华;姚文兵;;聚乙二醇修饰尿酸酶的研究(英文)[J];中国药科大学学报;2008年06期
2 孔庆胜;迮玉官;;聚乙二醇修饰超氧化物歧化酶的基础研究[J];济宁医学院学报;2006年01期
3 武文明;曾昭淳;李小彦;杨小兰;廖飞;;产朊假丝酵母尿酸酶的纯化和特性研究[J];西南大学学报(自然科学版);2008年03期
4 姜凌;蔡永明;曾勇;黄霁;陈拯民;;聚乙二醇化重组人生长激素在大鼠体内的药代动力学研究[J];药学学报;2009年05期
5 伍黎黎;沈富兵;刘敏;孟延发;;聚乙二醇修饰对α-苦瓜素抗肿瘤活性的影响[J];华西药学杂志;2011年01期
6 舒雅俊;黄慧;潘育方;黎小莉;刘莉;杨帆;;聚乙二醇化海葵神经毒素的稳定性考察[J];广东药学院学报;2011年02期
7 吴能森;;冠心病患者血尿酸水平变化特点的临床观察[J];中国现代药物应用;2011年12期
8 旷瑜;王金霞;王伯初;程永刚;肖中元;徐波;;蛋白类药物聚乙二醇修饰的研究[J];中国煤炭工业医学杂志;2008年02期
9 孙晓军;金磊;甘志勇;刘冬;;PEG-5000修饰后假丝酵母尿酸酶的基本特性[J];中国老年学杂志;2010年19期
10 王娜;谭群友;徐美玲;李艺;赵春景;张景勍;;产朊假丝酵母尿酸酶脂质体的酶学性质及其免疫原性[J];中国生物制品学杂志;2011年05期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张典瑞;;聚乙二醇修饰的冬凌草甲素纳米脂质载体的构建及评价[A];2011年中国药学大会暨第11届中国药师周论文集[C];2011年
2 林晓;姜艳;王卓君;冯怡;徐德生;沈岚;;麦冬多糖MDG-1聚乙二醇修饰物的合成与药动学研究[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
3 张纯;杨晓兰;冯涓;廖飞;;多肽/蛋白药物的聚乙二醇修饰:现状和展望[A];重庆市化学化工学会2009学术年会论文集[C];2009年
4 孙学峰;王正;;聚乙二醇修饰牛血红蛋白血液替代品的初步研究[A];中华医学会第六次全国胸心血管外科学术会议论文集(胸外科分册)[C];2006年
5 张更辉;林小燕;阎虎生;;聚乙二醇修饰小分子多肽的凝胶化行为[A];2009年全国高分子学术论文报告会论文摘要集(下册)[C];2009年
6 刘霞;丁志山;蒋福升;;聚乙二醇修饰小分子药物的研究进展[A];2009浙江省中药学术年会论文集[C];2009年
7 梁士民;张磊;胡铁强;;蛋白药物聚乙二醇化研究进展[A];中国生物工程学会第四次会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2005年
8 王薇;熊微;万江陵;徐辉碧;杨祥良;;聚乙二醇修饰降低聚酰胺-胺树状大分子细胞毒性的机理研究(英文)[A];第十届中国科协年会论文集(三)[C];2008年
9 陈华洁;陈安国;杨彩梅;洪奇华;;樟科、蒜属和丝兰属植物提取物对肉鸡排泄物中脲酶与尿酸酶活性及氨态氮含量的影响[A];中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十次学术研讨会论文集[C];2008年
10 邹佳;陈方;尚明美;董立厚;欧伦;孙效;李娜;刘秀文;宋海峰;;聚乙二醇修饰对艾塞纳肽在动物体内药代动力学行为影响研究[A];第九届全国药物和化学异物代谢学术会议论文集[C];2009年
中国重要报纸全文数据库 前3条
1 杜朋;易混淆的常用西药名[N];医药养生保健报;2005年
2 北京大学第三医院风湿免疫科 郑晓娟 刘湘源;应对痛风 不同时期策略不同[N];健康报;2011年
3 第二军医大学长海医院风湿免疫科主任 赵东宝 整理 朱奎 邱志涛;痛风患者无需零嘌呤饮食[N];健康报;2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张淳;PEG修饰人犬嵌合尿酸酶结构功能研究及临床前药理学评价[D];华东理工大学;2012年
2 白坚石;聚乙二醇修饰血红蛋白制备红细胞代用品的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2000年
3 陈海霞;尿酸对血管内皮细胞氧化应激反应的影响及其对细胞的损伤作用[D];中南大学;2012年
4 张锡平;重组灵芝免疫调节蛋白的聚乙二醇修饰及产物纯化[D];吉林大学;2013年
5 王娜;聚乙二醇修饰的可生物降解聚酯药物载体的研究[D];天津大学;2007年
6 王彦;人睫状神经因子类似物rh-CNTF(A~(17)R~(63)15)的重组制备、PEG修饰和生物学特性研究[D];重庆医科大学;2009年
7 于爱平;溶栓抗凝双功能融合蛋白的构建表达和功能研究及PEG修饰的水蛭素缓释剂型的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
8 邹贵勉;社区和临床高尿酸血症及其相关疾病系列研究[D];南方医科大学;2011年
9 刘增臣;氮杂环类金属配合物及四氧化三铁纳米粒子负载多羧酸类金属配合物的生物活性及荧光性能研究[D];兰州大学;2012年
10 刘志刚;泄浊除痹方治疗高尿酸血症物质基础研究[D];广州中医药大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张纯;尿酸酶的聚乙二醇修饰及其成药性的初步评价[D];重庆医科大学;2011年
2 张锐;聚乙二醇化尿酸酶的制备、纯化及性质研究[D];四川大学;2007年
3 孙晓军;mPEG修饰对产朊假丝酵母与一种未鉴定念珠菌尿酸酶的影响[D];重庆医科大学;2010年
4 彭建春;人血浆中尿酸及嘌呤物质的含量测定[D];重庆医科大学;2012年
5 孟尧;长效尿酸酶(URICASE-PEG40KD结合物)的制备及基本性质研究[D];四川大学;2007年
6 冯一建;重组人角质细胞生长因子-I聚乙二醇修饰及体内外活性研究[D];重庆理工大学;2012年
7 陈远翔;重组苛求芽孢杆菌尿酸酶诊断性能评估[D];重庆理工大学;2012年
8 邬丹;尿酸与2型糖尿病代谢紊乱及危险因素分析[D];南方医科大学;2011年
9 蔡小飞;聚乙二醇修饰对牛乳β-乳球蛋白的致敏性与构象变化的研究[D];南昌大学;2012年
10 马亚;尿酸与血管内皮损伤的基础与临床研究[D];北京协和医学院;2012年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026