二聚体突变引物定量PCR技术的研发及其临床应用

【摘要】：实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)技术分为内掺式染料技术和探针技术两类。内掺式染料技术方法简单,成本较低,但特异性差,故不适于临床检测。探针技术采用了基于荧光淬灭原理或荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)的探针,包括TaqMan探针、Amplifluor探针、分子信标、蝎型探针等。这些探针均是在与模板互补的同一寡核苷酸链上,分别标记荧光基团和淬灭基团,特异性高,定量准确,因而被广泛应用于临床诊断中。但这些探针均属于多标记探针,其合成难度和成本较高,制约了其推广应用。不少研究人员试图采用单标记探针来降低合成难度和成本,如杂交探针(hybridization probes)和荧光置换探针(displacing probes),取得了较好效果。但为防止探针与靶序列杂交引起自身延伸而被破坏,仍然需要在探针末端磷酸化来阻断其延伸,因此,并非真正意义的单标记探针技术。 基于上述分析,本课题设计了一种全新的二聚体突变引物,其具有独特的结构,为真正意义的单标记探针。与其它多标记荧光探针相比,二聚体突变引物有以下优点: 1.结构上具有天然的“热启动”功能,增加了方法的特异性; 2.荧光报告基团和淬灭基团空间距离近,报告基团可被有效抑制,降低了方法的本底,一旦扩增开始两者便彻底分离,产生的荧光信号强,增加了方法的灵敏度; 3.真正实现荧光探针的单标记,降低了合成、纯化难度,因此降低了成本。 这种新型定量检测系统既具有染料法对新生双链DNA均能示踪、成本低的特点,又具有探针法高特异性,是一种高通用性、高特异性和灵敏性、操作简单、价廉的新型real-time PCR技术。 我们选取乙型肝炎病毒和沙眼衣原体为具体研究对象,系统地对二聚体突变引物技术进行方法学和临床应用价值评价。证实二聚体突变引物技术具有高灵敏度、宽线性范围、重复性好、检测成本低等优点,可用于临床病原体检测或流行病学调查研究。

【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R440