收藏本站
《重庆医科大学》 2011年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

渗透压对人气道上皮细胞黏蛋白5AC分泌的调控研究

涂静  
【摘要】:目的: 气道黏液高分泌是慢性气道炎症性疾病包括慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘和肺囊性纤维化等疾病的一个重要病理特征。人支气管上皮细胞黏液增多是炎症级联反应的结果,水、无机盐离子和黏蛋白(mucin, MUC)等大分子构成气道黏液层,黏液潴留可导致病变气道阻塞加重,并为气道定植细菌提供良好的培养基,同时可释放多种促分泌因子加剧黏液潴留过程[1,2,3],从而加快疾病的进程并使病情恶化。理论上黏液层物理和化学性质的任何改变都会影响黏液性状和分泌量,已知MUC5AC是气道主要分泌型MUC,是超负荷生成病理性黏液中的主要成分,作为炎症气道黏蛋白的主要特征性表型,决定着高分泌黏液的病理特征[4,5]。目前对MUC5AC基因表达和分泌的相关分子机制已广泛开展,已知体内多种炎症介质和细胞外因素如白介素(interleukin, IL)-4、IL-13、IL-9、IL-6、IL-1β、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF-α)、中性粒细胞弹力酶(neutrophil elastase, NE) [11]、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)配体[12]、空气污染物[13]、细菌产物[14]、类花生酸类、自由基[15]和氧化应激[16]等刺激均可以导致MUC5AC的异常,但是对临床上常见的高渗盐水可诱导排痰的分子机制却并不清楚,渗透压改变的条件下对MUC5AC分泌的效应尚无报道。既往研究发现气道上皮细胞黏液出胞过程中黏液分泌颗粒复合物形成必需热休克蛋白(heat shock proteins, HSP)70参与[17], HSP70可在多种刺激下诱导表达以保护气道细胞,并与蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)有关[18],渗透压反应增强子结合蛋白(osmotic response element binding protein, OREBP/ nuclear factor of activated T cells, NFAT5/ toncity-responsive binding-protein, TonEBP)是哺乳动物细胞内唯一已知渗透压相关转录因子,可调控HSP70等的表达,保护细胞免受高渗应激[19]。本研究选用体外培养人支气道上皮细胞株HBE16的方法,以常见的高渗盐水作为干预因素,探讨渗透压刺激对MUC5AC分泌的效应,以及HSP70、PKC和OREBP在黏液分泌中的机制,研究高渗下OREBP对HSP70的调控作用及其对MUC5AC分泌的影响,从而深入阐明高渗在气道慢性炎症性疾病黏液分泌中的可能机制,并为能从基因和分子水平解释有效的临床防治措施提供实验依据。 方法: 细胞培养和高渗处理:体外培养正常人气道上皮HBE16细胞株,加入10%高渗氯化钠配成不同浓度的高渗培养基,渗透压计检测渗透压。高渗培养前用无激素和无血清培养基培养。四甲基偶氮唑盐光吸收法(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT法)检测细胞活性。PKC各亚型抑制剂和OREBP siRNA做为干扰因素处理高渗培养HBE16细胞。 蛋白表达和转录水平的检测:采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测培养上清中MUC5AC蛋白含量作为评价黏液分泌量的指标;Western Blot检测HSP70-2和OREBP蛋白表达,RT-PCR方法半定量检测HSP70-2转录水平。细胞免疫化学和激光共聚焦技术观察细胞在高渗下HSP70-2和OREBP蛋白表达的变化。 HSP70-2基因上游不同长度启动子序列荧光素酶(luciferase, Luc)报告基因质粒载体的设计和构建:从HBE16细胞中抽提人基因组DNA序列为模板,根据HSP70-2基因启动子上游调控区的基因序列及质粒表达载体pGL3-Basic的结构特点及实验需要设计扩增引物,PCR扩增HSP70-2基因启动子上游5’端不同片断,经酶切和DNA测序鉴定证实HSP70-2基因启动子上游序列系列截短的荧光素酶报告基因表达质粒构建成功。 含人HSP70-2基因启动子渗透压反应增强子(osmotic response element, ORE)位点定点突变序列荧光素酶报告基因质粒载体的设计和构建:基因启动子软件分析提示HSP70-2基因启动子上游存在两个潜在的ORE,ORE1位于转录起始点-1975位,ORE2位于-93位。ORE的共有序列为:TGGAANNNYNY (Y为T或C,N为任一碱基)。设计并导入定点突变引物使HSP70-2启动子上游的两个ORE位点分别单独失活。含人HSP70-2基因上游ORE位点定点突变序列荧光素酶报告基因质粒经酶切和DNA测序鉴定证实构建成功。 细胞转染和荧光素酶活性测定:报告基因质粒和OREBP siRNA通过脂质体2000共转染HBE16细胞,连续培养24h和48h后加高渗处理,12小时孵育后收集细胞,采用双荧光素酶报告基因检测系统计算报告基因的相对表达水平。 结果: 1、高渗能有效刺激HBE16细胞培养上清MUC5AC蛋白分泌量增加,与对照组相比较差异显著,有统计学意义,且结果显示在所选实验浓度范围内(500和600mOsm/kgH2O) MUC5AC随培养时间和培养浓度的改变对高渗盐水刺激有时间和剂量依赖关系(p 0.05)。当渗透浓度增加到1000mOsm/kgH2O时HBE16细胞存活率降低,与对照组相比,差异有显著性(p 0.05)。 2、高渗培养后,OREBP和HSP70-2蛋白在细胞内的荧光表达显著增加,HSP70-2蛋白和转录水平较对照组显著升高,并随着培养时间的延长而逐渐增加(p 0.05),同时OREBP蛋白表达增加,且随培养时间延长而逐渐增加(p 0.01)。 3、用PKCμ抑制剂G?6976处理高渗培养下HBE16细胞,培养上清MUC5AC蛋白含量、HSP70-2蛋白和转录水平较高渗组显著降低(p 0.01),但仍高于对照组(p 0.05);而PKCα抑制剂Safingol,PKCβ抑制剂LY333531和PKCδ抑制剂Rottlerin处理细胞后,上述指标水平无显著改变。 4、siRNA抑制OREBP表达后,高渗刺激下的OREBP、HSP70-2和上清MUC5AC蛋白相对含量显著减少(p均0.05)。 5、成功构建系列截短的HSP70-2启动子荧光素酶报告基因质粒,真核细胞转染技术与OREBP siRNA共转染导入HBE16细胞,观察高渗刺激下的细胞,结果显示转染分别含2、1、1个ORE位点的pGL3-HSP70-2(-2181/+165)-Luc、pGL3-HSP70-2(-1394/+165)-Luc和pGL3-HSP70-2(-353/+165)-Luc细胞后在高渗刺激下的荧光素酶比活性无明显改变(p0.05);而转染HSP70-2启动子不含ORE位点的pGL3-HSP70-2(-66/+165)-Luc细胞在高渗刺激下的荧光素酶比活性与高渗组的细胞相比显著降低(p0.01)。 6、构建突变-1975位点的ORE1和位于-93位点的ORE2的HSP70-2启动子报告基因载体,与OREBP siRNA共转染细胞后检测,突变ORE1后细胞在高渗刺激下的荧光素酶表达与高渗组相比无显著改变(p0.05);突变ORE2后高渗刺激下的荧光素酶比活性与高渗组比较显著降低有统计学意义(p0.01)。 结论: 1、高渗刺激可诱导体外培养的HBE16细胞MUC5AC分泌,在所选实验浓度范围内呈现时间和浓度依赖关系,但同时高渗对HBE16细胞活力的影响也逐步加大,随渗透时间延长和渗透浓度加大细胞存活率下降。 2、高渗培养后,OREBP和HSP70-2蛋白在细胞内的荧光表达显著增加,HSP70-2蛋白和转录水平,OREBP蛋白水平均显著增加,提示HSP70-2和OREBP参与高渗致HBE16细胞MUC5AC分泌过程。用PKCμ抑制剂处理高渗培养下细胞,HSP70-2蛋白、转录水平和MUC5AC分泌较高渗组显著减少,但仍高于对照组;而用PKCα抑制剂、PKCβ抑制剂和PKCδ抑制剂处理后HSP70-2蛋白、转录水平和MUC5AC分泌均无改变,考虑高渗致黏液分泌可能是部分通过PKCμ-HSP70-2依赖的信号通路。siRNA抑制OREBP表达后,高渗刺激下的OREBP、HSP70-2和上清MUC5AC蛋白相对含量显著减少,进一步证实OREBP和HSP70-2参与高渗下黏液分泌的过程。 3、成功构建系列截短的HSP70-2上游启动子荧光素酶报告基因质粒和含两个ORE位点突变的HSP70-2启动子荧光素酶报告基因质粒,为今后深入开展高渗对黏液分泌的调控机制奠定基础。 4、高渗刺激可分别诱导HSP70-2启动子含2、1、1个ORE位点的pGL3-HSP70-2(-2181/+165)-Luc、pGL3-HSP70-2(-1394/+165)-Luc和pGL3-HSP70-2(-353/+165)-Luc序列的报告基因质粒仍然表达荧光素酶,而不含ORE位点的pGL3-HSP70-2(-66/+165)-Luc序列的报告基因质粒对高渗刺激无反应,不表达荧光素酶,说明在HSP70-2启动子上游-66到-353序列之间存在ORE关键位点。 5、高渗刺激可诱导HSP70-2启动子-1975位点的ORE1发生定点突变序列的报告基因质粒表达荧光素酶,而含有-93位点的ORE2发生定点突变序列的报告基因质粒对高渗刺激无明显反映,提示高渗盐水诱导OREBP通过与HSP70-2启动子上-93位点的ORE结合而激活HSP70-2转录并促进HBE16细胞MUC5AC高分泌。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R562

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 ;Downregulation of NFAT5 by RNA interference reduces monoclonal antibody productivity of hybridoma cells[J];Cell Research;2007年03期
2 郭进军,黄爱龙,赵中夫,唐霓,申慧敏;全长乙型肝炎病毒基因组的扩增及序列分析[J];中华肝脏病杂志;2003年10期
3 ;Correlation between clinicopathology and expression of heat shock protein 70 and glucose-regulated protein 94 in human colonic adenocarcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2005年07期
4 ;MUC5AC EXPRESSION UP-REGULATION GOBLET CELL HYPERPLASIA IN THE AIRWAY OF PATIENTS WITH CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE[J];Chinese Medical Sciences Journal;2005年03期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 邱烈;管勤;袁英;;HSP70对组织细胞的保护[J];重庆医学;2009年15期
2 申元英;;中国大陆乙型肝炎病毒基因分型的研究进展[J];大理学院学报(自然科学);2006年08期
3 贾艳会;刘树业;;蛋白质组学及其在肝癌中的应用[J];实用肝脏病杂志;2007年05期
4 范江涛;谢青丽;廖雁;;HLA-I与HSP70在宫颈癌中的表达[J];广西医科大学学报;2012年05期
5 袁晖;杨蓓蓓;魏红权;;鼻息肉组织中杯状细胞密度与术后疗效的相关性分析[J];临床耳鼻咽喉头颈外科杂志;2008年11期
6 郭云鸿;田晓予;米建强;熊丽丽;;热休克蛋白70和热休克蛋白27在宫颈鳞癌中的表达及其意义[J];中原医刊;2006年24期
7 钮晓音;李小彦;陈广洁;;绿色荧光蛋白标记的GRP78蛋白表达和功能研究[J];南通医学院学报;2009年04期
8 王艳霞;李志超;刘彦仿;段春光;王常建;;葡萄胎和绒毛膜癌组织中葡萄糖调节蛋白94的表达及意义[J];中华肿瘤防治杂志;2007年21期
9 李延辉;夏明汗;康举龄;谢敏如;马少康;;HSP70和P53蛋白在甲状腺乳头状癌中的表达及其与临床病理特征的关系[J];现代生物医学进展;2011年13期
10 蒲红伟;张静;李晓梅;李桂红;陈晓;;食管鳞状细胞癌中MCM-2、Grp-94和MTA-1的表达及其临床病理学意义[J];陕西医学杂志;2010年10期
中国博士学位论文全文数据库 前6条
1 王征;结直肠癌肝转移分子标志物的研究[D];北京协和医学院;2011年
2 蔡萌;病原诱导启动子和组织特异性启动子的分离克隆和功能鉴定[D];华中农业大学;2007年
3 李升锦;中性粒细胞弹力酶对呼吸道黏蛋白5AC基因表达及其转录调控的影响[D];重庆医科大学;2007年
4 高翠娟;酿酒酵母耐乙醇特性的分析及代谢工程改造研究[D];山东大学;2010年
5 黄建康;HSP70在机体创伤应激及维持内环境稳定作用的实验研究[D];广西医科大学;2010年
6 李瑾昱;NK、T混合淋巴细胞联合顺铂或西妥昔单抗对NSCLC的体外实验研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 肖顺崇;不同切肝量大鼠肝脏HSP70、GR表达的变化及对内环境的影响[D];广西医科大学;2011年
2 谢青丽;HSP70与HLA-1在宫颈癌中的表达及相关性[D];广西医科大学;2011年
3 高恒毅;热休克蛋白105在胰腺癌中的表达及意义[D];华中科技大学;2010年
4 黄海龙;中国HIV-1主要流行重组株B'/C Tat基因第一外显子序列特征和功能分析[D];福建师范大学;2004年
5 吴彪;HSP70在骨巨细胞瘤中的表达及其意义的研究[D];中南大学;2007年
6 刘胜;热休克蛋白70-多肽复合物的纯化及其负载树突状细胞抗小鼠结肠癌作用的研究[D];福建医科大学;2007年
7 唐强;缺血预适应对小肠缺血再灌注损伤后c-fos/c-jun基因表达的影响及其保护作用[D];四川大学;2007年
8 姜如娇;SPT3定向进化提高酿酒酵母乙醇耐性的研究[D];大连理工大学;2009年
9 张悦;中国卤虫胚胎发育早期NFAT5的表达以及在高盐胁迫下的应答[D];辽宁师范大学;2009年
10 王丽双;大鼠心理应激模型建立及相关因素评价[D];吉林大学;2010年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 郝巧玲,吕斌,周宜开,程光明;生物发光法快速检测细胞内三磷酸腺苷[J];华中科技大学学报(医学版);2005年01期
2 尉继征;熊伟;祝庆余;;生物发光技术在活体成像检测中的应用[J];医学分子生物学杂志;2006年03期
3 樊粉霞;卫玮;柳惠图;张伟;;紫龙金对BGC-823细胞增殖的抑制作用及对p16~(INK4a)启动子活性的影响[J];北京师范大学学报(自然科学版);2010年01期
4 张华,供田洋,大村智;真菌KS-1995产生的增加LDLR基因表达的活性物质的研究[J];中国抗生素杂志;1998年04期
5 李淑德,许国铭,李兆申;鸡螺杆菌诱导胃上皮细胞白细胞介素8转录及病理意义[J];胃肠病学;2002年02期
6 黄瑞燕,许丽艳,许晓玲,方栩佳,陈波,牛永东,李恩民;NGAL基因5’侧翼区启动子区的克隆与鉴定[J];肿瘤防治研究;2005年06期
7 陈涛;Bhatta SK;刘建平;林浩铭;万云乐;陈翔;罗兴喜;区庆嘉;;应用生物荧光法检测三磷酸腺苷评估肝细胞功能储备(英文)[J];中国组织工程研究与临床康复;2008年42期
8 孟希亭;林晨;梅佳;王海娟;马飞;张金龙;张颖;钱海利;;活体成像系统检测携荧光素酶增殖缺陷型腺病毒在小鼠体内的表达和分布[J];中国肿瘤生物治疗杂志;2011年04期
9 王小红,王升启,李梦东,朱宝珍;HCV 5'NCR片段调控荧光素酶表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的表达[J];中华微生物学和免疫学杂志;1999年01期
10 贾战生,周永兴,焦成松;丙型肝炎病毒与荧光素酶融合基因细胞模型的初步建立[J];第四军医大学学报;2000年07期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 许丰雯;徐丹;王明晓;陈启民;耿运琪;乔文涛;;以荧光素酶为报告基因定量检测原型泡沫病毒的指示细胞系的建立[A];2010年第四届全国微生物遗传学学术研讨会论文摘要集[C];2010年
2 李风云;余军平;张治平;崔宗强;王殿冰;危宏平;张先恩;;溶液增强Gaussia荧光素酶的BRET传感器检测蛋白酶[A];中国化学会第28届学术年会第4分会场摘要集[C];2012年
3 徐明旭;赖茂毅;程宁;丁培国;夏东岚;芮珉;王莺;张颖妹;王露;韩文玲;马大龙;;CKLF基因与CKLFSF1基因间的顺式调控元件[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年
4 刘亚宁;刘成刚;赵新华;朱美财;陈涛;;利用生物发光测定PBP对荧光素酶复性的促进作用[A];第九次全国生物物理大会学术会议论文摘要集[C];2002年
5 陈倩;周福祥;於海军;谢丛华;周云峰;;肿瘤特异性生物发光真核表达载体的构建及其初步特点的研究[A];湖北省抗癌协会青年委员会成立大会暨第一届青年学术论坛资料汇编[C];2009年
6 岳伟伟;周爱玉;何保山;罗金平;蔡新霞;;基于生物发光技术的细菌总数快速检测仪[A];第十届全国敏感元件与传感器学术会议论文集[C];2007年
7 杜郁;杨媛;司书毅;洪斌;;人ApoA-I基因表达上调剂筛选模型的建立[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
8 郝永新;李雪莲;陈丹;刘群;;弓形虫瞬时转染中不同启动子介导的双报告基因优化[A];第二届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2008年
9 杨国斌;袁国华;陈硕;;BMP2调控DSPP基因转录由DLX3/OSX信号通路介导[A];全国第八次牙体牙髓病学学术会议论文汇编[C];2011年
10 陈浥尘;王渊;梁云兴;沈伟利;陈红;袁文俊;东野英明;;2型糖尿病OLETF与GK大鼠血管舒张功能及高糖/高渗机制[A];第八届海峡两岸心血管科学研讨会论文集[C];2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 济南医院糖尿病诊疗中心副主任医师 王建华;糖尿病非酮症高渗性昏迷抢救关键:补液“三板斧”[N];医药经济报;2011年
2 记者 陈勇 晓安;“改装”艾滋病毒成克癌“导弹”[N];新华每日电讯;2005年
3 记者 李红;让科学和艺术相结合[N];科技日报;2000年
4 本报记者 李婵;克隆猪身上发荧光[N];北京科技报;2004年
5 北京大学眼科中心 胡运韬;眼不花未必是好事[N];健康时报;2008年
6 本报记者 冯卫东;迈向人造生命的重要一步[N];科技日报;2009年
7 记者 第广龙;长庆天然气勘探在苏里格庙区获重大突破[N];中国石油报;2000年
8 郭焕玲;中原采油二厂科研项目通过中国石化专家鉴定[N];中国石化报;2009年
9 记者 汪亚萍 通讯员 王宏伟 王东;大港采六规模应用水平井深度开发[N];中国石油报;2009年
10 湖南 刘栋才 (教授);胃癌病人术后如何安排饮食[N];家庭医生报;2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 涂静;渗透压对人气道上皮细胞黏蛋白5AC分泌的调控研究[D];重庆医科大学;2011年
2 李维娜;乙型肝炎病毒编码蛋白对宿主炎性基因的调控作用及其机制研究[D];华中科技大学;2011年
3 高博;荧光素酶标记的HCV细胞模型的建立及其在药物评价等方面的应用[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年
4 姜轶群;利用海肾荧光素酶双分子互补技术研究Hsp90/Cdc37相互作用[D];吉林大学;2010年
5 张静;神经元限制性沉默因子对CART基因转录的调控作用及其机制研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年
6 徐霞;鸟氨酸脱羧酶(ODC)及转录因子RUNX3在胃癌中表达失调的分子机制研究[D];山东大学;2012年
7 王荡;口蹄疫病毒L~(pro)和3C~(pro)调控宿主抗病毒天然免疫反应的分子机制研究[D];华中农业大学;2011年
8 金平;多聚乙烯基亚胺介导的自杀基因系统对卵巢癌靶向杀伤效应的研究[D];山东大学;2005年
9 朱兰兰;海洋细菌P.leiognathi的发光性能研究及其在食品安全检测中的应用探索[D];中国海洋大学;2008年
10 何晓燕;let-7a靶向调控NIRF基因对肺癌A549细胞增殖的影响及分子机制研究[D];重庆医科大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 吴顺泉;多个microRNAs通过直接作用于p21的3'UTR调控p21基因的表达[D];福建医科大学;2010年
2 王礼翠;HCV丝氨酸蛋白酶活性监测体系的建立[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年
3 胡文秀;小鼠GSTK1基因启动子调控机制的初步研究[D];苏州大学;2012年
4 翟春媛;猪TLR4基因的突变与功能分析[D];东北农业大学;2010年
5 刘成柏;用生物发光免疫技术检测肝肿瘤标志物AFP在肝癌早期诊断中的研究[D];吉林大学;2005年
6 薛丽英;SV40增强子修饰的hTERT核心启动子靶向转录荧光素酶载体的构建和鉴定[D];天津医科大学;2005年
7 黄丽玲;水稻抗病相关基因OsDR2的分离克隆和功能鉴定[D];华中农业大学;2003年
8 刘艳杰;重组萤火虫荧光素酶及其稳定性研究[D];天津大学;2010年
9 徐燕;荧光素酶作为报告基因的丙型肝炎病毒细胞感染系统的建立和应用[D];复旦大学;2011年
10 王逸麟;狂犬病毒糖蛋白衍生肽作为新型穿膜肽携带荧光素酶的入脑研究[D];西南大学;2012年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026