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《重庆医科大学》 2011年
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复元胶囊对退行性骨关节炎软骨基质降解的防治研究

张文亮  
【摘要】:目的 研究体现补益肝肾与化瘀通络治法的复元胶囊及其活性成分对退行性骨关节炎关节软骨基质降解的保护作用,并从uPA系统、IκBα-NF-κB信号途径的角度探讨其作用机制。 方法 1新西兰大白兔48只,随机分为正常组、模型组、盐酸氨基葡萄糖胶囊组及复元胶囊低、中、高剂量组6组,每组8只。采用膝关节石膏制动法结合d-半乳糖30 mg/kg/d皮下注射6周建立兔衰老骨关节炎模型,造模当日即开始治疗,正常组、模型组予生理盐水10ml,盐酸氨基葡萄糖组剂量为90 mg/kg/d,复元胶囊低、中、高剂量组剂量分别为1350 mg/kg/d,2700 mg/kg/d,5400 mg/kg/d,灌胃,1次/日,连续10周。HE染色关节软骨Mankin’s评分,免疫组化学染色法检测软骨组织中尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及其特异性受体(uPAR)和抑制剂(PAI)的表达,Western检测各组软骨组织中uPA、NF-κB的表达。 2于24孔板中培养兔软骨组织,分为空白组、20%空白血清组、TNF-α模型组、uPA抑制剂阿米洛利组、5%、10%、20%复元胶囊含药血清组共7组。除空白组,各组均加入TNF-α10 ug/L诱导软骨组织基质降解, 1 h后,按实验分组加药。采用1,9-二甲基亚甲蓝法检测各组培养上清中氨基聚糖(GAG)的含量,以评价软骨基质中蛋白多糖降解的情况。采用碱水解法检测各组培养上清中羟脯氨酸(Hyp)释放的量,以评价软骨基质中胶原降解的情况。 3原代培养兔软骨细胞,MTT检测各组软骨细胞活性,筛选药物最佳作用浓度,分为7组:空白组、TNF-α模型组、盐酸氨基葡萄糖25 mg/m1组、20%复元胶囊含药血清组、淫羊藿苷12.5μg/ml组、三七皂苷R1 125μg/ml组、淫羊三七组(淫羊藿苷12.5μg/ml+三七皂苷125μg/ml)组, RT-PCR检测各组uPA、NF-κB(P65) mRNA的含量,EMSA检测NF-κB(P65)与DNA结合的活性,Western检测IκBα水平。 结果 1复元胶囊治疗兔骨关节炎10周后,各组病理Mankin’s评分分别为模型组8. 73±0. 94,盐酸氨基葡萄糖组3. 46±0.78,复元胶囊高剂量组3. 28±0. 46。结果显示复元胶囊可改善兔骨关节炎软骨病变,复元胶囊高剂量与模型组比较差异有显著性(P0.01),与盐酸氨基葡萄糖组比较差异无显著性(P0.05)。 免疫组化显示uPA、uPAR及PAI阳性表达定位于软骨细胞的细胞质,呈黄色或棕黄色颗粒。模型组中uPA、uPAR及PAI阳性细胞率分别为79.61±2.78,60.55±1.35,52.33±2.87,盐酸氨基葡萄糖组为35.38±2.31 , 30.4±1.34 , 72.35±1.52 ,复元胶囊高剂量组分别为36.45±1.35,31.35±1.18,66.57±1.25,结果显示复元胶囊高剂量治疗后uPA及uPAR降低,PAI升高,与模型组比较差异有显著性(P0.01),与盐酸氨基葡萄糖组比较差异无显著性(P0.05)。 Western blot检测结果,模型组uPA/GAPDH、NF-κB/GAPDH为1.13692±0.2451,0.89828±0.1650,盐酸氨基葡萄糖组为0.25147±0.0537,0.36386±0.0458,复元胶囊高剂量组为0.26003±0.0427,0.25315±0.0336,结果提示复元胶囊高剂量组能显著降低兔关节软骨中uPA、NF-κB表达,与模型组比较差异有显著性(P0.01),复元胶囊中、高剂量组对NF-κB的抑制作用强于盐酸氨基葡萄糖组(P0.05)。 2复元胶囊对兔软骨组织块基质分解代谢产物GAG、Hyp的研究显示,空白组仅有微量释放,分别为1.32±0.18,0.05±0.01,TNF-α模型组则有显著释放,分别为4.76±0.39,0.89±0.07,两组比较差异有显著性(P0.01)。uPA抑制剂阿米洛利组GAG、Hyp含量分别为1.85±0.21,0.41±0.06,20%复元胶囊含药血清组分别为2.92±0.34,0.64±0.07。结果显示,复元胶囊有一定抑制软骨基质中蛋白多糖及胶原降解的作用,20%复元胶囊含药血清组GAG、Hyp的释放较TNF-α模型组显著降低(P0.01),但作用弱于阿米洛利(P0.01)。 3复元胶囊及其主要成份对兔软骨细胞实验,MTT法检测各组兔关节软骨细胞活性结果显示,复元胶囊含药血清、淫羊藿苷、三七皂苷R1、淫羊藿苷+三七皂苷R1均能促进软骨细胞增殖活性,以48 h时作用最明显,与空白组比较差异有统计学意义(P0.01 ),复元胶囊含药血清组作用最强,优于阳性对照盐酸氨基葡萄糖组(p0.05)。 RT-PCR实验显示,空白组uPA、NF-κB(p65)mRNA表达量分别为0.225±0.016,0.202±0.014,TNF-α模型组为0.429±0.018,0.463±0.021,较空白组明显升高(P0.01)。盐酸氨基葡萄糖组、复元胶囊含药血清组、淫羊藿苷组、三七皂苷R1组、淫羊藿苷+三七皂苷R1组uPA mRNA的表达分别为0242±0.019,0.254±0.012,0.273±0.013,0.247±0.015,0.236±0.014 ; NF-κB ( p65 ) mRNA的表达分别为0.243±0.017 ,0.229±0.012,0.281±0.011,0.262±0.015,0.232±0.014。结果表明,各实验用药组都能显著降低uPA、NF-κB(P65) mRNA水平,与TNF-α模型组比较有显著差异(P0.01),但各给药组间无明显差异(P0. 05)。 EMSA实验检测NF-κB(p65)与DNA的结合活性结果显示,空白组结合电泳条带光密度A值为47.72±8.19 , TNF-α模型组为141.25±31.83,较空白组显著升高(P0.01)。盐酸氨基葡萄糖组、复元胶囊含药血清组、淫羊藿苷组、三七皂苷R1组、淫羊藿苷+三七皂苷R1组分别为84.28±19.04、52.85±11.42、86.66±35.23、91.15±28.67、71.47±10.57,反映各药物组细胞内NF-κB(p65)与DNA的结合活性均不同程度下降,与TNF-α模型组比较差异有统计学意义(P0.01),其中复元胶囊含药血清组作用最强,淫羊藿苷+三七皂苷R1组显示协同效应,均优于阳性对照盐酸氨基葡萄糖组(P0.01),复元胶囊含药血清组作用优于淫羊藿苷+三七皂苷R1组(P0.01)。 Western blot检测各组IκBα的表达,空白组IκBα表达量为0.348±0.025,TNF-α模型组为0.374±0.032,与空白组无显著差异(P0.05)。盐酸氨基葡萄糖组、复元胶囊含药血清组、淫羊藿苷组、三七皂苷R1组、淫羊藿苷+三七皂苷R1组IκBα的表达分别为0.739±0.028,0.763±0.021,0.824±0.035,0.793±0.024,0.832±0.023,与模型组比较明显升高(P0.01)。各中药组与盐酸氨基葡萄糖组比较差异无显著性(P0.05)。 结论 1复元胶囊可明显改善兔骨关节病理改变,降低Mankin’s评分。复元胶囊能显著降低兔关节软骨中uPA、uPAR、NF-κB的表达,明显升高PAI的表达。提示复元胶囊可能通过调控uPA系统对骨关节炎发挥防治作用。 2复元胶囊含药血清对兔软骨组织块GAG、Hyp有明显下调作用,表明复元胶囊具有一定抑制软骨基质中蛋白多糖及胶原降解的作用。 3复元胶囊及其主要成份淫羊藿苷、三七皂苷R1均能促进软骨细胞增殖活性,显著降低uPA、NF-κB(P65) mRNA水平,降低NF-κB(p65)与DNA的结合活性,升高细胞内IκBα水平。提示复元胶囊及其主要成份可能通过升高IκBα水平,降低NF-κB (P65)的活性,从而降低uPA的表达,保护软骨细胞免受炎症因子的损伤。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R285.5

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8 刘丰;护心胶囊预防心房颤动复发的临床研究[D];黑龙江中医药大学;2003年
9 宋卫青;清暗胶囊的质量标准研究[D];山西医科大学;2002年
10 王丽妮;“寿百星”胶囊提高免疫抑制肿瘤的理论及实验研究[D];北京中医药大学;2005年
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