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《重庆医科大学》 2011年
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化疗后乳腺癌组织中的癌干细胞微球体分离培养与鉴定

董华英  
【摘要】:近年来研究表明,乳腺癌是一种干细胞疾病,其起源于体内少数具有自我更新和多向分化潜能的细胞亚群,该群细胞具有极强的致瘤能力,即乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells, BrCSCs)。BrCSCs在乳腺癌的发病、侵袭、转移、治疗抵抗和复发等方面起着关键作用。BrCSCs的发现从全新的视角认识乳腺癌这一疾病,为乳腺癌的防治提供了新的思路。由于BrCSCs在乳腺癌原发肿瘤中含量极低,所以细胞的获取已经成为BrCSCs相关研究的技术瓶颈。因此,如何分离获取BrCSCs,研究其生物学行为和可能的调控机制,对明确乳腺癌的发病机理、了解乳腺癌的诊断预后、制定乳腺癌的个体化治疗方案和最终根治乳腺癌等有着重要意义。据报道,接受化疗的乳腺癌患者的乳腺癌组织和循环血液中CD44+CD24-表型BrCSCs比例明显增加,利用化疗药物联合无血清悬浮培养可富集和纯化小鼠的BrCSCs。但是,不同周期化疗对BrCSCs分离培养的影响以及化疗后BrCSCs在乳腺癌组织中的存在方式(形态)并不清楚。因此,如何从新辅助化疗后的乳腺癌组织中获取BrCSCs值得探讨。我们在从乳腺癌组织中分离BrCSCs的过程中发现,新辅助化疗后的部分乳腺癌组织中可分离出的一种球体状细胞团,与文献报道中所培养的乳腺癌干细胞微球体(mammospheres,MSs)形态极其相似,因其来源于化疗后乳腺癌组织,为了表述方便和避免文中与MSs相混淆,故将其命名为乳腺癌化疗微球体(chemotherapy microspheres,CMSs)。本研究拟通过体外培养、诱导分化、细胞表型分析、干细胞相关标记物检测和动物致瘤实验等方法,对CMSs进行鉴定,并探讨了不同周期化疗对CMSs分离的影响以及CMSs、不同周期化疗与乳腺癌分子亚型之间的关系,以期为BrCSCs获取的新方法提供实验依据。 第一部分乳腺癌化疗微球体的分离培养与细胞表型分析 目的观察CMSs和MSs的形态差异;探讨乳腺癌化疗微球体细胞(chemotherapy microsphere-derived cells, CMSDCs)的自我更新和多向分化能力;分析CMSDCs及其分化细胞的表型差异。初步鉴定CMSDCs是否具有肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)的特性。 方法将CMSs接种于添加生长因子的无血清培养基中悬浮培养,观察CMSs在培养基中的球体形态和折光性的变化,比较CMSs与MSs之间的差异;应用连续无血清传代生成新的CMSs检测CMSDCs的自我更新能力,血清诱导CMSDCs分化检测其分化能力;采用免疫荧光标记法,激光共聚焦显微镜观察上皮特异性抗原(ESA)、巢蛋白(Nestin)在CMSDCs中的表达;检测细胞角蛋白CK14、细胞角蛋白CK18和细胞角蛋白CK19在CMSDCs及其分化细胞中的表达;流式细胞术检测CMSDCs中CD44+CD24-表型细胞的比例;ALDEFLUOR实验检测CMSDCs及其分化细胞中ALDH1+表型细胞的比例。 结果CMSs在无血清培养基中继续呈球状生长,与MSs形态相似,培养3 d后球体折光性增强,球体表面出现坏死的细胞层;CMSDCs可连续传代形成新的CMSs,经血清诱导后细胞贴壁生长,由圆形变成梭形;CMSDCs呈ESA阳性表达,而不表达神经干细胞标记物Nestin,证实其为上皮细胞来源;CMSDCs表达乳腺干/祖细胞标记物CK19,而不表达分化标记物CK14和CK18,CMSDCs的分化细胞则表达CK14和CK18,而不表达CK19;3例标本中仅有1例标本的CMSDCs中含有CD44+CD24-表型细胞;3例标本的CMSDCs中均含有ALDH1+表型细胞,诱导分化后该表型细胞比例大幅度下降。 结论CMSDCs在体外具有自我更新和多向分化潜能,含有较高比例的ALDH1+表型细胞。CMSs可能是化疗压力下扩增形成的富含BrCSCs的细胞微球体。 第二部分乳腺癌化疗微球体细胞耐药性及其Oct-4和ABCG2的表达 目的检测CMSDCs及其分化细胞的耐药性,干细胞相关标记物Oct-4和多药耐药蛋白ABCG2在CMSDCs及其分化细胞中的表达,进一步对CMSDCs进行鉴定。 方法MTT法检测多西他赛和表柔比星对CMSDCs及其分化细胞的抑制率;采用RT-PCR技术检测CMSDCs及其分化细胞中Oct-4基因的表达;应用Western blot检测CMSDCs及其分化细胞中ABCG2蛋白的表达 结果CMSDCs对多西他赛和表柔比星耐药,而其分化细胞对上述药物敏感;CMSDCs高表达Oct-4和ABCG2,分化后上述标记物表达降低或缺失。 结论CMSDCs对化疗药物耐药,表达干细胞相关标记物Oct-4和多药耐药标记物ABCG2,符合肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)的特征。 第三部分乳腺癌化疗微球体细胞的动物致瘤实验 目的检测CMSDCs及其分化细胞的动物致瘤性,探讨小鼠成瘤细胞的生物学特性,进一步对CMSDCs进行鉴定。 方法构建NOD/SCID小鼠乳腺脂肪垫移植肿瘤模型,观察CMSDCs的成瘤情况;检测小鼠肿瘤细胞中ALDH1~+表型细胞的比例;观察小鼠肿瘤细胞在无血清培养基中的克隆球形成能力,球体细胞在含血清培养基中的分化情况。 结果1×10~3个CMSDCs即可在NOD/SCID小鼠乳腺脂肪垫内重建肿瘤,而相同数量的分化细胞不能在小鼠体内成瘤;小鼠肿瘤细胞内含有少量的ALDH1~+表型细胞;小鼠肿瘤细胞在体外无血清培养基中可形成MSs,并能连续传代,MSDCs血清诱导可贴壁生长。 结论CMSDCs具有极强的致瘤性,小鼠肿瘤细胞与亲代细胞特性相似。CMSDCs符合干细胞的特征,可用于乳腺癌干/祖细胞的研究。 第四部分不同周期化疗对乳腺癌化疗微球体形成的影响 目的探讨不同化疗周期对CMSs形成的影响,为从化疗后的乳腺癌组织中分离BrCSCs提供实验依据。 方法从化疗后的乳腺癌组织中分离细胞,在无血清培养基中悬浮培养,观察有无CMSs形成;通过无血清培养并绘制生长曲线,评估不同化疗周期标本CMSDCs的增殖能力;通过克隆形成实验,计算CMSs形成率(mammosphere forming efficiency, MSFE),评估不同化疗周期标本的CMSDCs的自我更新能力;血清诱导CMSDCs分化,测绘生长曲线,评估不同化疗周期标本CMSDCs的分化能力;流式细胞术检测不同化疗周期标本CMSDCs中ALDH1~+表型细胞比例。 结果化疗1个周期的7例乳腺癌标本经培养均无CMSs形成,化疗2个周期的6例标本经培养其中3例有CMSs形成,化疗3个周期以上的16例标本中11例可以直接分离出CMSs,其余4例仅得到少量坏死的细胞和组织碎片;CMSDCs在含血清的培养基中贴壁分化。化疗3个周期以上的CMSDCs相对于化疗2个周期的CMSDCs传代次数多,增殖速度快,贴壁能力强,含有更高比例的ALDH1~+表型细胞。CMSs多见于基底样乳腺癌和Her2过表达型乳腺癌。 结论从化疗后的乳腺癌组织中分离BrCSCs宜选取化疗3个周期及以上的标本;新辅助化疗促进了BrCSCs的自我更新和分化能力;ALDH1+表型的BrCSCs比CD44+CD24-表型的BrCSCs在乳腺癌中分布更加广泛;CMSs的产生与乳腺癌的某些分子亚型有关。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R737.9

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