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《重庆医科大学》 2011年
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重症联合免疫缺陷小鼠内毒素血症巨噬细胞的生物学特性

罗冲  
【摘要】:背景与目的脓毒症是严重感染、创伤、烧伤、外科大手术患者常见的并发症,进一步发展可导致脓毒症休克和多器官功能障碍综合征(MODS),是临床危重患者死亡的最主要原因之一。全球脓毒症患者总病例数约为1800万/年,美国患病人数为75万/年,欧洲为13.5万/年。全世界死亡人数超过1.4万/天,美国21.5万/年,并成为美国非心脏ICU死亡的主因。目前对脓毒症的认识及治疗措施有所改进,但脓毒症的病死率仍然居高不下,已成为现代危重病医学面临的突出难题。根本原因源于脓毒症的根本发病环节及作用机制尚未充分阐明,故而缺乏早期有效的预防与治疗措施。 失控的全身炎症反应是脓毒症预后不良的重要原因之一。固有免疫细胞是炎症反应的重要参与者,其异常活化可导致失控炎症反应的发生。感染相关的噬血细胞综合征(IAHS)及重症急性呼吸道综合征(SARS)、重症H1N1等高致死性流行病毒感染性疾病,其病理生理特点亦为失控的全身炎症反应综合征。以上疾病存在着固有免疫细胞的异常活化,是疾病发生的重要原因之一,但对于何种原因导致固有免疫细胞的异常活化需要进一步研究。近年的研究显示了固有免疫细胞与适应性免疫细胞在炎症反应中相互作用的复杂性。我们的前期研究显示T细胞缺陷裸鼠感染呼吸道合胞病毒(RSV)后,炎症反应重于野生型小鼠,提示T细胞可能抑制炎症反应发生。Kim的研究显示炎症早期,淋巴细胞可抑制固有免疫细胞活化。由此,我们推测,脓毒症,IAHS及SARS等的发生可能与机体体内淋巴细胞不同程度功能缺陷导致固有免疫细胞异常活化相关。若能对淋巴细胞缺陷动物脓毒症中固有免疫细胞活化及功能特征进行研究,也许能为以上疾病的发病环节及作用机制研究提供新的思路。 内毒素在革兰阴性细菌感染所致脓毒症的发病机制中扮演重要作用,甚至细菌血培养阴性时,也存在内毒素血症,提示内毒素血症可是脓毒血症的单独致病因素。内毒素具有极广泛而又复杂的生物学效应,脓毒症病理过程中出现的失控炎症反应、免疫机能紊乱、高代谢状态及多脏器功能损害均可由内毒素直接或间接触发。淋巴细胞缺陷的重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠革兰阴性细菌感染模型的病理性免疫反应(炎症反应)取决于细菌的持续繁殖扩散和宿主的免疫反应。这一模型给研究单一免疫反应带来困难。为避免此类情况的发生,我们拟采用脂多糖(LPS)腹腔注射诱导T、B细胞缺陷重症联合免疫缺陷小鼠内毒素血症,通过观察SCID小鼠巨噬细胞生物学特性,从而揭示淋巴细胞缺陷对炎症反应的影响以及对巨噬细胞活化的调控作用及其作用可能的分子机制,为脓毒症的防治提供新的方向和理论依据。 目的在LPS诱导的BALB/c小鼠和SCID小鼠内毒素血症模型基础上,比较两种小鼠炎症反应的差异,观察淋巴细胞缺陷对固有免疫应答及炎症反应的影响。 方法LPS腹腔注射BALB/c小鼠和SCID小鼠后,观察小鼠的一般状况及存活率。将32只雄性BALB/c小鼠和32只雄性SCID小鼠随机分为正常对照组,LPS注射后3 h,6 h和12 h组。取小鼠的血清,肝脏及肺脏组织;用全自动生化分析仪检测两种小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及血尿素氮(BUN)水平;用H.E染色,双盲法评估肝脏,肺脏的炎症病理损伤;用流式细胞术微球阵列法(CBA)检测两种小鼠血清TNF-α, IFN-γ, IL-10, IL-6及MCP-1的水平;用ELISA检测两种小鼠血清IL-12, IL-4及IL-17的水平及肝组织匀浆TNF-α及IL-10的水平。 结果LPS诱导内毒素血症后,SCID小鼠于12~24 h均死亡(8/8),BALB/c小鼠仅1只死亡(1/8);LPS注射后12 h,SCID小鼠血清ALT、AST均高于BALB/c小鼠,两种小鼠BUN无显著差异;SCID小鼠肝脏、肺脏病理评分均高于BALB/c小鼠;LPS注射后,两种小鼠血清TNF-α,IFN-γ,IL-10,IL-6,MCP-1及IL-4的水平均显著升高,且SCID小鼠以上细胞因子水平明显高于BALB/c小鼠;LPS注射后3 h,SCID小鼠肝组织匀浆TNF-α水平高于BALB/c小鼠,注射后6 h,IL-10水平高于BALB/c小鼠。 结论LPS诱导小鼠内毒素血症后,与野生型BALB/c小鼠比较,SCID小鼠分泌过量的炎性及抗炎细胞因子,出现失控的炎症反应,导致严重的脏器损伤,是SCID小鼠死亡的重要原因。固有免疫应答在缺乏淋巴细胞的状态下异常增强,可能是发生危及生命的重症全身炎症反应综合征的重要原因。 第二部分脂多糖诱导的BALB/c小鼠与SCID小鼠内毒素血症腹腔巨噬细胞活化及功能的比较 目的在LPS诱导的BALB/c小鼠和SCID小鼠内毒素血症模型基础上,比较BALB/c小鼠及SCID小鼠腹腔巨噬细胞活化及功能的差异。观察淋巴细胞缺陷对巨噬细胞活化及功能的影响。 方法将40只雄性BALB/c小鼠和40只雄性SCID小鼠各自随机分为正常对照组,LPS注射后1 h,3 h,6 h和12 h组。取小鼠的腹腔灌洗液,腹腔巨噬细胞和小鼠脾脏NK细胞;用ELISA检测腹腔灌洗液TNF-α和IL-10的水平;用实时荧光定量PCR检测腹腔巨噬细胞TNF-α和IL-10 mRNA表达;流式细胞术检测BALB/c小鼠及SCID小鼠正常对照组及LPS注射后3 h组腹腔巨噬细胞TLR4,MHC-II,CD80,CD86及CD40的表达及LPS注射后12 h脾脏NK细胞胞内细胞因子IFN-γ水平;鸡红细胞吞噬实验检测两种小鼠正常对照组腹腔巨噬细胞吞噬功能;并提取两种小鼠正常对照组腹腔巨噬细胞体外LPS刺激培养,测定上清中TNF-α, IL-6, IL-10, IL-17及IFN-γ的水平。 结果LPS注射后1 h,SCID小鼠腹腔灌洗液TNF-α水平高于BALB/c小鼠,注射后3 h,IL-10水平明显低于BALB/c小鼠;正常对照组及LPS注射后3 h,6 h和12 h组,SCID小鼠腹腔巨噬细胞TNF-αmRNA表达高于BALB/c小鼠;正常对照组及LPS注射后各时间点,SCID小鼠腹腔巨噬细胞IL-10 mRNA表达均低于BALB/c小鼠。BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率及吞噬指数均高于SCID小鼠腹腔巨噬细胞;LPS注射后,BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞TLR4, MHC-II, CD80, CD86表达均明显升高,SCID小鼠腹腔巨噬细胞TLR4, MHC-II, CD86表达无明显变化,BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞CD40及SCID小鼠腹腔巨噬细胞CD80,CD40均明显下降;SCID小鼠NK细胞胞内IFN-γ平均荧光值高于BALB/c小鼠NK细胞。体外实验LPS刺激20h后,SCID小鼠腹腔巨噬细胞较BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞分泌更多的TNF-α,IL-6,但IL-10的分泌明显偏少。 结论与野生型BALB/c小鼠比较,SCID小鼠腹腔巨噬细胞共刺激分子CD80、CD86的表达自发性增高,吞噬功能明显下降。经LPS刺激后,腹腔巨噬细胞TLR4和MHC-II和CD80、CD86分子表达无增高,但分泌的炎性细胞因子显著增加,且NK细胞胞内IFN-γ水平增高。以上表现是SCID小鼠内毒素血症炎症反应失控的主要特点。 第三部分MKP-1在淋巴细胞对巨噬细胞活化调控中的作用 目的在LPS诱导的BALB/c小鼠和SCID小鼠内毒素血症模型基础上,筛选出可能参与淋巴细胞对巨噬细胞活化调控的信号分子。于体外建立单独腹腔巨噬细胞组及腹腔巨噬细胞+pan-T细胞混合培养组模型,采用LPS刺激后,明确所筛选出分子的表达及作用。 方法将40只雄性BALB/c小鼠和40只雄性SCID小鼠各自随机分为正常对照组,LPS注射后1 h,3 h,6 h和12 h组。提取腹腔巨噬细胞;采用实时荧光定量PCR检测腹腔巨噬细胞SOCS1, SOCS3及MKP-1的mRNA表达,免疫荧光检测腹腔巨噬细胞MKP-1蛋白表达。提取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞及脾脏pan-T细胞建立单独腹腔巨噬细胞组及腹腔巨噬细胞+pan-T细胞混合培养组模型;LPS刺激后,提取贴壁腹腔巨噬细胞及细胞培养上清;实时荧光定量PCR检测MKP-1 mRNA的表达;Western Blot检测腹腔巨噬细胞MKP-1蛋白表达水平;用ELISA检测上清中TNF-α、IL-6及IL-10的水平。 结果在LPS注射后3 h及6 h,SCID小鼠腹腔巨噬细胞SOCS1 mRNA表达明显高于BALB/c小鼠;在LPS注射后1 h及12 h,BALB/c小鼠SOCS3表达明显高于SCID小鼠。正常对照组及LPS注射后, BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞MKP-1 mRNA的表达均高于SCID小鼠腹腔巨噬细胞。体外实验,LPS刺激后,腹腔巨噬细胞与pan-T细胞共培养细胞中腹腔巨噬细胞MKP-1 mRNA及蛋白表达高于单独培养腹腔巨噬细胞;上清中TNF-α、IL-6水平明显低于单独培养巨噬细胞,IL-10水平无显著差异。 结论内毒素血症小鼠淋巴细胞并非通过SOCS1和SOCS3信号分子调控巨噬细胞活化。Pan-T细胞可抑制LPS刺激下巨噬细胞炎性细胞因子释放。在LPS诱导炎症反应小鼠模型中淋巴细胞可能通过促进巨噬细胞MKP-1表达,抑制其炎性细胞因子的产生。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R392

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【参考文献】
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