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《重庆医科大学》 2011年
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抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体对结直肠癌靶向治疗的研究

杨闯  
【摘要】:第一部分抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体的制备 目的探讨生物素―链霉亲和素桥接作用制备抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体。 方法采用逆向旋转蒸发法制备生物素化的聚乙二醇脂质体(PEG-脂质体),通过生物素―链霉亲和素桥接作用将生物素化VEGFR2单克隆抗体与生物素化的PEG-脂质体连接,构建抗VEGFR2-免疫脂质体。采用激光粒度仪、扫描电镜分析脂质体的粒径和电位大小;激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测抗VEGFR2-免疫脂质体的特征及抗体活性;高效液相色谱仪分析抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体的包封率及体外药物释放率。 结果免疫脂质体的平均粒径为185.34±28.08 nm,电位为-19.98±2.96 mv。脂质体呈球型,分散均匀,无聚集粘附成团现象;激光共聚焦显示罗丹明标记的二抗可在抗VEGFR2-免疫脂质体表面有效结合,流式细胞仪检测结合率达75%以上;高效液相色谱仪分析免疫脂质体的包封率为(58.07±6.94)%,体外累积释放率在120 h可达89%以上。 结论通过链霉亲和素与生物素桥接作用将生物素化VEGFR2构建在生物化PEG-脂质体表面是一种可行的方法,制备的抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体具有一定的包封率和体外释放率。 第二部分抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体对人结直肠癌THC8307/L-OHP细胞的靶向效应 目的探讨抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体对人结直肠癌THC8307/L-OHP细胞的凋亡诱导作用及可能机制。 方法采用免疫荧光、Western blot和RT-PCR分析VEGFR2在THC8307/L-OHP细胞的表达;流式细胞仪、免疫荧光、扫描电镜分析抗VEGFR2-免疫脂质体对THC8307/L-OHP细胞的靶向结合。MTT筛选给药浓度,分析抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体对THC8307/L-OHP细胞的毒性。THC8307/L-OHP细胞经抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体处理,流式细胞仪及TUNEL分析细胞的凋亡与增殖;RT-PCR分析Bcl-2、Bax、Caspase-3、Ki-67 mRNA的表达;Western blot检测Bcl-2、Bax、活化Caspase-3/P17蛋白的表达;免疫组化分析Ki-67阳性细胞数;检测P38、ERK、JNK的mRNA和蛋白的表达变化。THC8307/L-OHP细胞经SP600125预处理后,分析抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体对细胞凋亡调节。 结果与HUVEC比较,VEGFR2在THC8307/L-OHP细胞有高表达。抗VEGFR2-免疫脂质体与THC8307/L-OHP细胞的结合能力高于非免疫脂质体(P0.05);游离奥沙利铂(50μg/ml),奥沙利铂PEG-脂质体(含奥沙利铂50μg/ml)和抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体(含奥沙利铂50μg/ml)分别处理THC8307/L-OHP细胞12 h,细胞凋亡率分别为(10.02±0.69)%,(15.29±1.70)%和(55.89±8.90)%,正常组为(6.69±0.35)%。各组间比较,差异有统计学意义(P0.01,P0.05)。TUNEL检测THC8307/L-OHP细胞凋亡量的变化趋势与流式结果类似;CFSE平均荧光强度的相对比值分别为1.83±0.21,1.56±0.16和1.29±0.10。各组间比较,P0.05。Bcl-2、Ki-67的mRNA和蛋白的表达显著下调,Bax、Caspase-3的mRNA和蛋白的表达上则调(P 0.01,P0.05);在MAPK信号通路中,P38的mRNA和蛋白表达各组间比较无显著变化(P0.05),ERK表达随细胞凋亡的增加下调,JNK表达上调(P0.05)。SP600125预处理THC8307/L-OHP细胞后,抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体对细胞的凋亡作用不被SP600125抑制剂所抑制,Bcl-2的mRNA和蛋白的表达显著下调(P0.01),Bax、Caspase-3则上调(P0.01)。 结论抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体具有增强与THC8307/L-OHP细胞相结合的能力,并对细胞有显著凋亡诱导作用,可能与ERK、JNK信号通路参与凋亡调节有关。 第三部分抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体对裸鼠异种移植瘤的靶向作用 目的探讨抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体在裸鼠异种移植瘤体内的靶向效应。 方法建立裸鼠异种移植瘤模型,经尾静脉注射荧光标记(Dio标记)的抗VEGFR2-免疫脂质体,运用活体荧光显像和免疫荧光技术检测免疫脂质体在瘤体组织内的聚集能力;分析游离奥沙利铂(5μg/g),奥沙利铂PEG-脂质体(含奥沙利铂5μg/g),抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体(含奥沙利铂5μg/g)对荷瘤鼠的瘤体抑制率和生存期的影响;高效液相色谱法检测瘤体组织内药物的含量;免疫组化和Western blot分析瘤体细胞凋亡与增殖的变化。 结果活体荧光显像观察到Dio标记的抗VEGFR2-免疫脂质体在瘤体的聚集能力高于非免疫脂质体,免疫双标显示其在瘤体细胞内和血管周围大量分布;分别用游离奥沙利铂,PEG-奥沙利铂及抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体处理裸鼠,瘤体的抑制率为(39.55±9.38)%,(50.34±8.86)%和(61.20±9.77)%,组间比较差异有统计学意义(P0.05)。抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体处理组裸鼠的生存率高于其它各组;给药2 h后,游离奥沙利铂处理组瘤体组织内药物的含量明显降低。给药24 h后,奥沙利铂PEG-脂质体处理组和抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体处理组在瘤体组织内药物的含量均达高值,但抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体组的含量高于奥沙利铂PEG-脂质体组(P0.05),并且在72 h后仍可维持较高值;瘤体细胞的凋亡指数在抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体处理组显著高于其它各组(P0.001,P0.01,P0.05),而增殖指数显著低于其它各组(P0.001,P0.01,P0.05);Bcl-2蛋白表达下调,Bax、P17蛋白表达上调(P0.01,P0.05)。 结论抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体能有效抑制荷瘤鼠瘤体的生长,并影响瘤体细胞的凋亡与增殖。 第四部分抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体对人结直肠癌THC8307/L-OHP细胞多药耐药的影响 目的探讨抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体对人结直肠癌THC8307/L-OHP细胞的耐药逆转作用。 方法MTT方法分析抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体对THC8307/L-OHP细胞的耐药逆转倍数。免疫组化、RT-PCR、Western blot分析游离奥沙利铂和不同剂量的抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体处理细胞12 h,P-gp/MDR1、ABCG2的表达变化。分析相同剂量的抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体处理细胞不同时间,P-gp/MDR1、ABCG2的表达变化。采用Western blot分析游离奥沙利铂和不同剂量的抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体作用细胞48 h,ABCG2、P-gp/MDR1、GST3、Bcl-2和P17蛋白的表达变化。采用免疫组化技术分析瘤体组织ABCG2和P-gp/MDR1的阳性表达。 结果抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体对THC8307/L-OHP细胞的耐药逆转倍数为1.21。25μg/ml的游离奥沙利铂,抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体组Ⅰ(含25μg/ml奥沙利铂)和抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体组Ⅱ(含50μg/ml奥沙利铂)作用细胞12 h,P-gp/MDR1的mRNA表达分别为2.22±0.33,2.67±0.40,3.26±0.4(7组间比较,P0.05);ABCG2的mRNA表达分别为2.85±0.43,7.74±1.16,8.68±1.30(组间比较,P0.05与P0.01);P-gp/MDR1的蛋白表达分别为5.68±0.85,10.04±1.51,17.62±2.64。组间比较差异有显著性(P0.01);ABCG2蛋白表达分别为2.06±0.31,3.74±0.56,4.56±0.68。组间比较差异有显著性,P0.05和P0.01;抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体(含25μg/ml奥沙利铂)处理细胞12 h,24 h,48 h和72 h,P-gp/MDR1蛋白表达分别为8.57±1.28,16.36±2.45,3.42±0.51,0.75±0.11。各组间比较,差异有统计学意义(P0.01);ABCG2蛋白含量分别为1.27±0.19,2.13±0.32,1.63±0.24,0.55±0.08。各组间比较,差异有统计学意义(P0.05);P-gp/MDR1、ABCG2耐药基因的mRNA表达在24 h升高明显,72 h显著降低。与正常对照组比较,差异有统计学意义(P0.01,P0.05)。游离奥沙利铂和抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体(组Ⅰ、Ⅱ)作用细胞48 h,游离奥沙利铂处理组的P-gp/MDR1、ABCG2、GST3、Bcl-2、P17蛋白的表达无显著变化(P0.05,与正常对照组比较);抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体处理组(组Ⅰ,组Ⅱ)P-gp/MDR1、ABCG2、GST3、Bcl-2蛋白的表达呈下调趋势,P17则上调。各组间比较,差异有统计学意义(P0.01,P0.05);瘤体组织中存在P-gp/MDR1和ABCG2阳性细胞,但随处理因素增加其表达减弱。 结论抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体逆转THC8307/L-OHP细胞的多药耐药可能与P-gp/MDR1、ABCG2、GST3的下调有关。抗凋亡蛋白Bcl-2,Caspase-3可能参与抗VEGFR2-奥沙利铂免疫脂质体对THC8307/L-OHP细胞耐药性的调节。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R735.3

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