高效液相色谱法测定血样中甲硫氨酸代谢产物的方法学研究与应用

【摘要】：目的： 1.建立一种同时测定小鼠红细胞内S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)和S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)的高效液相色谱(HPLC)-程序波长紫外检测方法。 2.用所建立的HPLC-程序波长紫外检测方法测定叶酸缺乏小鼠和正常小鼠红细胞中SAM与SAH的浓度，从而了解叶酸缺乏小鼠红细胞中SAM与SAH的代谢状态。 3.建立测定人血浆中总同型半胱氨酸（totalhomocysteine,tHcy）的柱前衍生高效液相色谱-荧光检测方法（HPLC-FD）。 4.用建立的HPLC-FD方法分别测定了高血压患者和正常人血浆中tHcy的浓度。探讨高血压患者tHcy代谢变化情况。 方法： 1．小鼠红细胞内SAM和SAH的同时测定：红细胞样品经净化处理后，采用AgilentZORBA×Eclipse×DB-C8柱（150mm×4.6mm,5μm）进行分离。流动相为含3mmol/L庚烷磺酸钠的40mmol/L的磷酸二氢钠缓冲液（pH3.72）:甲醇95:5(v/v)，流速为0.9ml/min；柱温为35℃；紫外程序检测波长设定为0~8.00min,450nm,8.01~16.00min,260nm。进样量为20μl,检测时间为16.00min。利用此方法测定10例正常饮食小鼠和19例叶酸缺乏小鼠红细胞中SAM和SAH的浓度。 2．人血浆中tHcy的测定：tris-(2-carboxylethyl)-phosphine(TCEP)，N-(1-pyrenyl)maleimide(NPM)分别作为还原剂和衍生剂对血浆样品进行处理，采用AgilentHypersilODS柱(250.0mm×4.0mm，5μm)进行分离。采用梯度洗脱程序进行色谱分离，色谱流动相由15mmol/L醋酸钠溶液（A），乙腈（B），混合酸溶液（C）（300ml水中含1ml醋酸和1ml磷酸）组成，柱温设定为25℃，采用荧光检测的激发波长设定为330nm，荧光波长设定为380nm。用本方法分析测定了7例高血压患者和19例健康志愿者血浆tHcy的浓度。 结果: 1．SAH与SAM的保留时间分别为12.2min和13.6min，线性范围分别为0.25~3.0μg/ml和0.5~10μg/ml；检出限分别为0.15μg/ml和0.07μg/ml。SAH与SAM的日内变异系数与日间变异系数分别在1.0%～6.4%和1.3%～7.3%之间，两种分析物的平均回收率在80%~116%之间。 2．叶酸缺乏小鼠组红细胞中SAH浓度明显高于正常对照组小鼠组，两者间差异存在统计学意义（P0.01），而两组间SAM无显著差异。 3．tHcy的保留时间为5.8min，线性范围为0.500~100μmol/L,检出限为0.0160μmol/L，平均回收率为(102±4.9)%。日间与日内变异系数小于4%。高血压患者血浆tHcy高于健康对照组，两组间差异具有统计学意义（P0.05）。 结论： 1.本研究建立了同时测定小鼠红细胞中SAM和SAH浓度的HPLC-程序波长紫外检测方法。此方法操作简便，灵敏，准确度高，为小鼠SAM代谢研究提供实用可靠的方法。 2．本研究发现叶酸缺乏小鼠SAH的代谢发生了紊乱。 3.本研究建立了以NPM为衍生剂，TCEP为还原剂的tHcy柱前衍生荧光检测法。该方法采用了梯度洗脱缩短了分析时间。本方法简便，快捷，线性相关性好，准确度高，具有较高的实用价值，可用于血浆tHcy的科研和临床定量测定。