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《重庆医科大学》 2012年
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健康妇女阴道乳杆菌多样性分析及具有益生菌特征菌株的筛选

王江  
【摘要】:细菌性阴道炎(BV)是育龄期妇女常见的阴道感染性疾病,发病率占整个妇女人群的10%~29%。BV危害较大,容易引起输卵管炎、盆腔炎、宫外孕、不孕症、泌尿系感染、术后感染及妇科肿瘤等一系列并发症。BV的发生主要是健康阴道微生态平衡被破坏所致,主要表现为是阴道乳杆菌的减少或缺失。 乳杆菌是健康阴道微环境中的优势菌群,它对维持阴道微生态平衡起着重要作用。阴道乳杆菌主要通过与病原菌竞争营养物质;竞争阴道上皮细胞表面粘附受体;刺激机体产生局部免疫;产生乳酸、过氧化氢和抗菌素类活性物质来抑制病源微生物的侵入和过度生长,调节微生态平衡。研究表明,阴道乳杆菌具有拮抗病原菌的能力,在预防治疗阴道细菌性感染方面起着重要作用。目前,国内外虽然已有商品化用于BV治疗的乳杆菌制剂,并在临床应用上取得了一定疗效,但与理想还有差距,可能是因为有效成分菌株不产H_2O_2、粘附定植能力差或拮抗病原菌能力弱等因素影响所致。因此,本研究拟通过基因测序、rep-PCR基因分型等分子生物学方法,分离鉴定乳杆菌株,在乳杆菌亚种水平上筛选具有益生菌特征的优秀菌株为丰富临床乳杆菌制剂,开发一种安全、有效、实用性更强的临床用于BV临床治疗的高效安全的生态制剂奠定实验基础。 我们用MRS乳杆菌专用培养基对150例健康妇女阴道分泌物样本中的乳杆菌进行分离培养,通过rep-PCR基因分型和16S rRNA基因测序,分离鉴定获得12种乳杆菌共170株,其中最常见的有弯曲乳杆菌L. crispatus、詹氏乳杆菌L. jensenii、加氏乳杆菌L. gasseri和发酵乳杆菌L. fermentum四种,统计发现L. crispatus、L. jensenii亚种较多,L.gasseri、L. fermentum种类较单一,大部分健康妇女阴道中只有一种优势乳杆菌。在此基础上,我们筛选具有益生菌特征的乳杆菌,分别从以下几个方面进行:首选检测了乳杆菌产酸的能力,通过测量了乳杆菌发酵液的PH值,皆在4左右,说明乳杆菌产酸能力普遍较强。其次,检测了乳杆菌产H_2O_2能力,其中H_2O_2弱阳性有59株,阳性有28株,强阳性有46株。统计结果表明:75%以上健康妇女阴道乳杆菌产H_2O_2。然后,进一步对产H_2O_2强阳性的46株乳杆菌做粘附能力检测试验,其中有13株乳杆菌粘附HeLa细胞能力较强,粘附细菌数均在200CFU/个以上。然后,我们做了乳杆菌拮抗金葡菌生长实验,比较乳杆菌抑菌圈直径与Amp阳性参照抑菌圈直径比值大小,比值在0.8以上的菌株对金葡菌具有较强拮抗作用,共有7株。最后,我们模拟阴道内环境,初步探讨了乳杆菌与阴道上皮细胞(VEC)的粘附能力,结果表明,具有粘附VEC能力的乳杆菌能粘附大部分个体的VEC证实本研究筛选出来的功能乳杆菌具有普遍实用性,能治疗大部分BV。 本研究主要通过分子生物学方法分离鉴定阴道乳杆菌株,检测了乳杆菌产酸、产H_2O_2、粘附HeLa细胞和拮抗金葡菌的能力,共筛选出7株具有较强产酸、产H_2O_2、粘附HeLa细胞和拮抗金葡菌能力的乳杆菌,这7株乳杆菌可作为治疗BV的候选菌株进行深入研究。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R378

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