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《重庆医科大学》 2012年
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降钙素基因相关肽对未成熟肺氧化应激性损伤的保护作用及其Wnt7b/β-catenin信号机制

王少华  
【摘要】:第一部分不同浓度及时间氧暴露对未成熟鼠肺发育的影响 目的研究不同浓度及时间氧暴露后早产鼠肺组织病理学、肺泡化程度及胎鼠原代AECII存活的情况,了解不同氧浓度及其作用时间对未成熟肺发育的影响。 方法孕21d SD早产鼠21%(空气)、40%、60%、95%梯度浓度氧暴露不同时点光镜观察未成熟肺组织病理变化及肺泡化程度、酶标仪测定肺组织MDA含量及TAOC;原代培养的SD胎鼠AECII制备上述梯度浓度氧细胞模型,Annexin V/PI双标记法检测细胞死亡,MTT法评估AECII增殖,流式细胞仪测定细胞内ROS水平,酶标仪检测细胞TAOC。 结果动物实验发现40%氧暴露后3d、7d、14d早产鼠体质量及体质量增长、存活率与空气(常氧)对照组比较无显著性差异,60%氧暴露组3d、7d、14d各时点体质量及体质量增长、存活率均明显低于同时点空气对照组(p0.05),95%氧暴露组体质量及体质量增长、存活率降低程度更为显著(p0.01);光镜下观察空气对照组及40%氧暴露组3d、7d、14d肺组织未见病理改变,结构清楚,肺泡大小均一,无炎性渗出,RAC值逐渐升高,60%氧暴露后7d可见肺内小血管充血,少量炎性改变,14d时肺泡腔有所扩张且RAC值与空气对照组比较明显降低(p0.01),95%氧暴露3d即有肺小血管扩张充血、炎性浸润,7d时肺部炎症更为明显,14d炎症减轻,但肺泡结构简单化,7d、14d RAC值与同时点空气对照组比较明显减少(p0.01);40%氧暴露组及空气对照组肺组织MDA含量随暴露时间延长没有明显变化,两组间同时点MDA含量及TAOC无显著差异,60%氧暴露组MDA含量7d、14d时增多,同时TAOC降低,与同时点空气对照组比较有显著性差异(p0.01),95%氧暴露后3d、7d、14d肺组织MDA含量升高,TAOC降低,与空气对照组比较有显著性差异(p0.01)。体外细胞实验中观察到空气对照组即常氧条件下培养24h内的AECII呈立方生长良好,AECII特有结构板层小体较多,48h后细胞中可见板层小体排出留下的空泡,72h细胞生长不良,胞浆中空泡增多,板层小体颗粒基本消失,40%氧暴露组AECII体外培养6h、12h、24h、48h、72h细胞形态学改变与空气对照组相似,60%氧暴露24h AECII呈现生长不良状态,48h胞浆中出现空泡,72h后细胞变形,空泡增多,95%氧暴露6h后即可观察到AECII细胞间隙增宽,细胞连接松散,板层小体颗粒减少,12-24h后胞浆中空泡明显增多,细胞核肿胀,48-72h细胞肿胀,丧失正常形态结构;Annexin V/PI双标记法流式细胞学检测结果显示,40%氧暴露后6h、12h、24h、48h、72h早期凋亡细胞数及晚期凋亡、坏死细胞数与空气对照组比较均无明显差异,两组细胞在干预后72h早期凋亡细胞数均有所增加,与同组前一时点比较差别具统计学意义(p0.01),60%氧暴露后24h发生早期凋亡及晚期凋亡、坏死的细胞均增加,48h、72h死亡细胞数更多,与同时点空气对照组相比差异具有显著性(p0.05),95%氧暴露后6h、12h、24h、48h、72h随高氧暴露时间延长,发生死亡的细胞越多,较同时点空气对照组具显著性差异(p0.05),死亡细胞数较之60%氧暴露组亦明显增高(p0.05);MTT结果显示,与同时点空气对照组相比,40%氧暴露6h、12h、24h、48h、72h增殖活性无显著变化,两组细胞增殖均于24h达高峰,48h有所减缓,72h反而降低,与同时点空气对照组比较,60%氧暴露24h、48h、72h及95%氧暴露后6h、12h、24h,48h、72h增殖活性均明显降低(p0.01),细胞增殖活性随暴露时间延长降低越为明显(p0.05),与60%氧暴露组比较,95%氧暴露后增殖抑制效应更为显著(p0.01);40%氧暴露组及空气对照组细胞ROS含量随干预时间延长均无明显变化,两组间同时点ROS含量亦无显著差异,60%氧暴露组ROS水平随暴露时间延长时间逐渐升高,暴露12h、24h,48h、72h与同时点空气对照组比较有显著性差异(p0.01),95%氧暴露后6h细胞ROS含量即增多,且随暴露时间延长ROS含量的增加越为显著,各时点与空气对照组比较差异均具统计学意义(p0.01)。 结论:60%氧可以时间依赖及浓度依赖的方式造成肺组织氧化应激性损伤,诱导AECII死亡,抑制AECII增殖,导致未成熟肺发育停滞。 第二部分降钙素基因相关肽对未成熟鼠肺氧化应激性损伤的保护作用 目的通过研究高氧暴露后肺组织CGRP含量动态变化和CGRP拮抗剂CGRP8-37干预后肺组织病理学、RAC、MDA含量、TAOC的改变,以及CGRP干预后AECII细胞增殖、存活的变化,了解CGRP在氧化应激性肺损伤中的作用。 方法95%氧暴露制备整体动物及原代AECII典型高氧损伤模型,放射免疫法检测高氧暴露后肺组织匀浆CGRP含量的动态变化,CGRP受体拮抗剂CGRP8-37干预后观察肺组织病理学改变及RAC,酶标仪检测MDA含量及组织TAOC水平,外源性CGRP干预后测定细胞内ROS及TAOC,流式细胞学检测AECII细胞死亡,MTT法评估细胞增殖。 结果高氧暴露的肺组织CGRP含量随高氧暴露时间的延长而逐渐增高,于7d达到高峰,14d时CGRP含量虽较前有所降低但仍明显高于空气对照组水平(p0.01),光镜观察发现高氧暴露后早期肺组织炎症充血,继而出现肺泡数目减少,CGRP8-37干预后肺组织炎症加重,肺泡结构改建更为显著,肺组织MDA含量在高氧暴露3d后显著升高,同时TAOC明显减弱,CGRP8-37干预后3d、7d、14d MDA含量升高及TAOC降低的趋势更明显,与同时点单纯高氧暴露组比较均有统计学差异(p0.05);与空气对照组相比,高氧暴露后细胞内ROS水平明显增高(p0.01)而TAOC显著降低(p0.01),同时死亡细胞比例显著增多(p0.01)、细胞增殖活性减弱(p0.01),与单纯高氧暴露组比较,CGRP干预后细胞ROS水平下降、TAOC提升,细胞增殖活性增强(p0.01),AECII死亡明显下降(p0.05)。 结论氧化应激损伤后肺组织CGRP含量增高可能是未成熟肺自我保护机制之一。CGRP可减弱氧化应激对AECII增殖的抑制作用,减少细胞死亡从而改善AECII的存活,这可能是CGRP有利于肺发育及氧化应激性肺损伤修复的关键。 第三部分降钙素基因相关肽氧化应激肺损伤保护作用的Wnt7b/β-catenin信号机制 目的研究高氧暴露后早产鼠肺Wnt7b、β-catenin蛋白水平变化及高氧、CGRP干预后Wnt通路下游基因转录调控因子TCF、靶基因c-myc mRNA表达,了解Wnt信号转导途径是否参与了氧化应激导致的AECII损伤死亡和肺发育障碍及其与CGRP肺保护作用的关系。 方法western blot检测95%高氧暴露早产鼠肺组织及高氧、CGRP干预后原代AECII Wnt7b、β-catenin蛋白水平,RT-PCR测定TCF及c-myc mRNA表达。 结果高氧暴露后3d肺组织Wnt7b及β-catenin蛋白表达即较空气对照组显著增强(p0.05),7d时蛋白水平达到峰值,14d时表达有所下降,但仍明显高于空气对照组水平(p0.05);与空气对照组比较,高氧组AECII TCF及c-myc mRNA表达明显增强(p0.01),高氧+CGRP组较之单纯高氧暴露组TCF、c-myc mRNA表达水平升高更为显著(p0.01),空气+CGRP组TCF、c-myc基因表达强弱与空气对照组无显著差异。 结论高氧暴露后Wnt7b/β-catenin信号通路激活,启动下游增殖相关基因转录,可能是氧化应激性肺损伤时AECII自我修复的机制之一。 CGRP可促进Wnt7b/β-catenin的活化,Wnt7b/β-catenin信号转导途径可能参与了CGRP的肺保护作用。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R363

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【参考文献】
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