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《重庆医科大学》 2012年
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构建基于热休克反应信号转导的“与门”基因电路及其在肿瘤靶向基因治疗中的作用机制研究

丁淼  
【摘要】:目的:放射导向的基因治疗是近年来提出的肿瘤治疗新策略,利用射线诱导治疗基因表达,二者协同作用杀伤肿瘤具有可喜的应用前景。但放射线虽然可严格控制治疗基因局限于照射野内表达,但照射野内不免包括瘤周正常组织,而治疗基因在瘤周表达将导致不必要的正常组织损伤。本研究利用肿瘤组织的缺氧特异性,设计一个以放射、缺氧为输入因子的“与门”基因电路,使其在放射、缺氧同时存在的条件下,治疗基因表达才得以启动,使治疗基因表达局限于受照射的缺氧肿瘤组织,增加了基因治疗的肿瘤特异性,最大限度的保护了正常组织。本实验的目的是利用连接天然存在的基因逻辑电路-热休克反应信号转导通路中各个信号反应元件和cArG启动子的辐射诱导特性,通过连接抑癌基因wtp53,构建辐射/乏氧双敏感性调控治疗基因表达的“与门”基因电路。 方法:在GenBank中查找放射敏感性反应元件cArG和酵母热休克反应元件HSE的基因序列,应用DNA合成仪,采用互补寡核苷酸退火方法分别合成双链增强子序列。采用反转录病毒载体plxsn-EGFP为骨架,在转录调控位点插入上述合成序列。应用PCR扩增技术扩增SNF1、HSF1和p53的cDNA序列,然后分别在cArG6的下游插入SNF1和HSF1的序列构成对照载体plxsn-EGFP;将位于HSE4下游的EGFP更换为wtp53的cDNA序列,构成治疗载体plxsn-wtp53。分别采用测序分析、单酶切和双酶切方法鉴定重组载体的构建是否成功。 结果:经测序分析,重组载体的DNA序列结果与预期全相符,与NCBI公布的cArG、SNF1、HSF1、HSE、EGFP和p53序列的ORF进行比对,发现正确性高达100%。而SNF1、HSF1和p53的基因片段经单酶切和双酶切处理后,酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳可见与预期的基因片段大小相符的特异性片段。 结论: 1、测序结果证明重组“与门”基因电路的各个反应元件未发生基因突变。 2、测序和酶切鉴定证明重组“与门”基因电路构建成功。 目的:验证前期构建的重组质粒能否产生“与门”效应,即是否仅在照射和缺氧条件下被激活。 方法:将前期构建的报告载体plxsn-EGFP和治疗载体plxsn-wtp53转染A549细胞株后给予不同处理,荧光显微镜下观察各处理组绿色荧光蛋白的表达,并采用western-blotting方法检测基因电路中各个反应元件SNF1、HSF1和p53的蛋白表达差异。 结果: 1、转染plxsn-EGFP质粒的A549细胞经6Gy照射与1%O_2处理24h后,可见绿色荧光蛋白表达,但表达量较低,48h后EGFP表达量急剧升高,满视野呈片状融合,72h呈持续高表达状态。但经单纯照射或缺氧处理的A549细胞内却未见EGFP表达。 2、western-blotting实验证明SNF1和HSF1蛋白在转染后并经照射与缺氧处理的A549细胞内表达最强(P0.01),在转染后经照射处理的细胞内表达量也较其他组有明显升高(P0.01),证明了射线能够激活SNF1和HSF1的表达。但p53表达情况则略有不同,虽然在转染经照射和缺氧处理后的细胞内表达量最高(P0.01),但在接受照射的细胞内,其表达量也较其他组略有升高。 结论: 1、EGFP表达结果证明重组“与门”基因电路仅能在放射和缺氧条件下得以激活,具有“与门”特征。 2、Western-blotting结果证明放射反应元件的射线敏感性,能够在6Gy照射条件下激活下游基因的表达。 3、p53的western-blotting结果证明在A549细胞内,射线能够激活p53的表达,这也与此前的多个研究结果相一致。 目的:评估前期构建的“与门”基因电路被激活后产生的抗癌效应,以期为临床提供新的并且有效的肿瘤治疗方法。 方法:A549细胞转染plxsn-wtp53质粒并经不同处理后,分别于24h、48h和72h收集细胞,采用流式细胞仪测定细胞周期改变和细胞凋亡比例。采用CCK-8方法测定不同处理组的细胞增殖速率。裸鼠荷瘤,并在肿瘤体积生长至60mm~3,体重达到18g时进行瘤内质粒注射,并于第二天行局部2Gy照射,质粒注射和局部照射连续重复三次。观察不同处理组裸鼠移植瘤生长情况,绘制肿瘤生长曲线。治疗3天后处死裸鼠,摘取肿瘤标本,采用H&E染色观察移植瘤的常规病理改变,免疫组化方法检测wtp53在不同处理组的表达和移植瘤内的细胞凋亡率。 结果:1、与对照组相比,经放射和缺氧处理24h、48h和72h后,转染plxsn-wtp53质粒的A549细胞进入G0/G1期、S期的细胞明显增多,进入G2/M期的细胞明显减少,与正常组和对照组相比都具有显著性差异(P0.05)。 2、A549细胞经plxsn-wtp53转染并经放射与缺氧处理后,凋亡细胞显著增多,在24h、48h和72h的细胞凋亡率与正常组和对照组相比都具有显著性差异(P0.01)。 3、以转染plxsn-wtp53质粒干预A549细胞增殖情况。结果表明转染的A549细胞经放射与缺氧处理后,在48h和72h时增殖效应明显减慢,与正常组和对照组相比具有显著性差异(P0.05)。 4、明显的肿瘤抑制效应在wtp53+radiation组可以观察到。虽然肿瘤在处理的6天内生长缓慢,从60mm~3到70mm~3,但是处理结束后,肿瘤平均体积随时间延长持续缩小,到第13天时,已缩小到59mm3,与其他对照组相比,具有统计学差异(P0.05)。 5、病理检查发现,注射plxsn-wtp53组在经照射3天后的移植瘤标本内出现显著性细胞凋亡,细胞缩小,胞核固缩,胞质空泡明显,形成较多凋亡小体。 6、给药3天后采用免疫组化染色法检测p53的表达。从图中可以看出,p53主要表达于核被膜及核周间隙。并且可见正常组和单纯质粒注射组表达p53的阳性细胞数量极少,经过照射处理后的移植瘤内阳性细胞数有所升高,而注射plxsn-wtp53质粒并接受6Gy局部照射的移植瘤内的阳性细胞数量最多,与其他组相比具有统计学差异(P0.01)。 7、给药3天后采用TUNEL原位凋亡检测试剂盒检测移植瘤内A549细胞凋亡率。结果可见凋亡细胞呈深褐色阳性反应,正常组阳性细胞数量极少,经过照射或注射质粒处理后的移植瘤内凋亡细胞数量 有所升高,而注射plxsn-wtp53质粒并接受6Gy局部照射的移植瘤内阳性细胞数量最多,凋亡率较其他组升高明显(P0.01)。 8、给药3天后免疫组化检测不同处理组内缺氧诱导因子HIF-1α的表达。结果表明各个处理组内均可见HIF-1α蛋白表达。且表达量各组未见明显差异。 结论: 1、“与门”基因电路激活后能够产生明显的促进A549细胞凋亡,抑制增殖和抑制细胞有丝分裂作用。 2、“与门”基因电路在活体内同样能够产生抑制肿瘤生长和促进肿瘤细胞凋亡作用,从侧面证实了“与门”基因电路应用于人体的可行性。 3、缺氧诱导因子HIF-1α的表达证实了A549移植瘤内存在缺氧区域。 目的:由于不同类型的肿瘤细胞对射线的反应性不同,甚至同一类型的肿瘤组织的不同区域也对射线的反应性有差异,因此,不同肿瘤对射线的吸收程度也不相同,这就造成了我们前期构建的“与门”基因电路的效应在不同程度上的削弱。因此,本研究将进一步探讨前期构建的“与门”基因电路是否可以根据射线的照射剂量调节,使其更适用于临床应用。 方法:采用流式细胞仪检测不同照射剂量引起的A549细胞和293细胞的凋亡率,分析2Gy照射剂量与前期的6Gy射线引起的肿瘤细胞和正常细胞的凋亡差异。A549细胞、HeLa细胞、HepG2细胞和MCF-7细胞分别转染plxsn-EGFP质粒,并经过2Gy照射和1%O2处理,于不同时间段观察绿色荧光蛋白的表达改变。A549细胞转染治疗质粒plxsn-wtp53,分别于24h、48h和72h于倒置显微镜下观察细胞形态学改变。RT-PCR和western-blotting方法检测不同处理组wtp53mRNA和蛋白的改变。采用流式细胞仪测定细胞周期和细胞凋亡比例。采用CCK-8方法测定不同处理组的细胞增殖速率。Western-blotting方法检测凋亡相关因子BAX和BCL-2的改变。裸鼠荷瘤,并在肿瘤体积生长至60mm3,体重达到18g时进行瘤内plxsn-wtp53质粒注射,并于第二天进行局部2Gy照射。治疗3天后处死动物,采用H&E染色观察移植瘤的常规病理改变,免疫组化方法检测EGFP和wtp53蛋白在不同处理组的表达和移植瘤内的肿瘤细胞凋亡率。免疫荧光双标检测不同处理的移植瘤内HIF-1α和wtp53的共表达情况。 结果: 1、从不同放射剂量照射下的细胞凋亡曲线中可以看出,6Gy引起的293细胞凋亡率很高,达到70%左右,但2Gy引起的293细胞的凋亡率较低,只有20%左右,因此我们选择2Gy作为照射刺激因子,能够引起较少的正常细胞损伤。同样,从图中可以看到,缺氧能够引起更多的正常细胞损伤,但是缺氧却能够使肿瘤细胞对射线产生耐受,引起的细胞死亡率较正常A549细胞低。 2、荧光显微镜下观察不同处理组的EGFP表达。可见转染plxsn-EGFP质粒的A549细胞经2Gy照射与3h缺氧处理后,24h绿色荧光蛋白表达明显,但表达量低,48h后表达量急剧升高,72h呈持续高表达状态。而其他处理组的细胞内却未见任何EGFP表达。 3、采用RT-PCR方法检测不同时间段wtp53mRNA的表达。可见放射和缺氧处理24h后,转染组内有少量wtp53表达,较正常组有少量升高,48h后wtp53表达量急剧升高,显著高于正常组和对照组(P0.01),72h wtp53呈持续高表达状态,与正常组和对照组相比,同样具有显著性差异(P0.01)。 4、由于肿瘤细胞内的p53为突变型,因此p53蛋白在正常组和对照组内均未见表达。24h转染组也未见wtp53表达,说明24h蛋白表达量低,但48h和72h后转染组可见高表达的wtp53蛋白,与正常组和对照组相比具有显著性差异(P0.01)。这与wtp53基因的mRNA表达水平检测结果一致。 5、以转染plxsn-wtp53质粒干预A549细胞。24、48和72h时400倍显微镜下观察到的wtp53组与正常组和对照组相比,细胞间隙增大,细胞量见少,凋亡细胞增多。 6、采用细胞增殖实验检测不同处理组的细胞增殖效应。结果表明在24h和48h时转染组细胞增殖率低于正常组和对照组,具有统计学差异(P0.05)。但转染72h后各组细胞增殖差异不显著,可能与肿瘤细胞生长速度快,72h时三组细胞全部布满瓶底有关。 7、wtp53组经放射和缺氧处理24h后,进入G0/G1期、S期的细胞数量三组并无明显差异;当作用48h后,转染组与正常组和对照组相比进入G0/G1期、S期的细胞明显增多,进入G2/M期的细胞明显减少。 8、转染组在放射与缺氧处理后,凋亡率显著升高,在24h、48h和72h都具有明显促凋亡作用,与正常组和对照组相比均具有显著性差异(P0.01)。 9、转染48h后,wtp53组可见促凋亡蛋白BAX表达明显增高,抑凋亡蛋白BCL-2表达量明显减少,与正常组和对照组相比具有显著性差异(P0.01)。 10、给药3天后采用免疫组化法检测EGFP的表达。可见EGFP表达仅在注射过plxsn-EGFP质粒并接受照射处理的肿瘤组织内可以检测到,其余处理组内均未见阳性细胞表达。 11、裸鼠皮下注射A549细胞,在肿瘤生长至第13天的时候瘤内注射plxsn-wtp53质粒,并进行2Gy局部照射,给药3天后将裸鼠处死,摘取肿瘤标本,H&E染色行病理检查。结果提示注射plxsn-wtp53并接受照射的移植瘤内出现显著性细胞凋亡,细胞缩小,胞核固缩,胞质空泡明显,形成较多凋亡小体。 12、给药3天后采用TUNEL原位凋亡检测试剂盒检测移植瘤内A549细胞凋亡率,凋亡细胞呈深褐色阳性反应。结果可见正常组和对照组阳性细胞数量极少,经过2Gy照射处理后的移植瘤内阳性细胞数量有所升高,而注射plxsn-wtp53质粒并接受2Gy局部照射的移植瘤内凋亡细胞数量最多,其凋亡率较其他组升高明显(P0.01)。 13、给药3天后采用免疫组化染色法检测p53的表达。可见p53主要表达于核被膜及核周间隙,且正常组表达p53的阳性细胞数量极少,经过照射处理后的移植瘤内阳性细胞数量有所升高,证明射线能够诱导p53的表达。而注射plxsn-wtp53质粒并接受2Gy局部照射的移植瘤内表达p53的阳性细胞数量较其他组升高明显(P0.01)。 14、给药3天后采用免疫荧光双标检测HIF-1α和wtp53蛋白的共表达。可见不同组间的HIF-1α蛋白的表达未见明显区别(绿色荧光),但是,wtp53的表达(红色荧光)在不同处理组却有明显区别。正常组,照射组,注射plxsn-wtp53质粒组的肿瘤组织内仅见少量wtp53表达,但是注射plxsn-wtp53质粒并接受照射处理的肿瘤组织内却可见明显的wtp53表达,且与HIF-1α蛋白成共表达状态。 15、为了进一步验证我们构建的基因电路的“与门”特点,我们将重组的plxsn-EGFP质粒转染HeLa、HepG2和MCF-7细胞株,并经过照射和缺氧处理48h后,观察绿色荧光蛋白表达情况。从图中可以看出,EGFP仅在接受6Gy照射和缺氧的细胞内表达,其余各组均未见表达。 结论: 1、2Gy射线和1%O2可以激活重组的“与门”基因电路。 2、重组“与门”基因电路可以根据放射剂量进行调节。 3、被激活的“与门”电路能够产生明显的抑癌效应,并引起更小的正常组织损伤。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R730.5

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1 康保国;放射诱导同步放大基因电路调控HSV-TK表达及其生物学效应的研究[D];第三军医大学;2007年
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