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《重庆医科大学》 2012年
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TCF7L2基因多态性及RNA干扰对胰岛素原水平的影响及机制

郑晓雅  
【摘要】:目的:探讨重庆地区汉族人群中TCF7L2(Transcription factor7-like2)、PCSK1(Proprotein convertase subtilisin/kexin type1)和PCSK2(Proprotein convertase subtilisin/kexin type2)的单核苷酸多态性(Singlenucleotide polymorphisms, SNPs)和新诊2型糖尿病(Type2diabetesmellitus, T2DM)及血清胰岛素原水平的相关性。 方法:采用病例-对照研究方法,研究对象包括对照组(n=152例),新诊T2DM组(n=227例)。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术对TCF7L2的rs7903146和rs11196218、PCSK1的rs3811951和PCSK2的rs2021785位点进行SNPs分型。采用酶联免疫法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)测定空腹血清胰岛素原水平。统计学分析采用SAS8.1软件,遗传学分析采用在线软件完成。 结果:Hardy-Weinberg平衡检验P0.05,拟合度优良。连锁不平衡分析发现TCF7L2的rs7903146和rs11196218位点不存在连锁不平衡现象,不能构建单倍型(D'=0.348, r~2=0.018)。T2DM组PCSK2的rs2021785位点次要等位基因频率(Minor allele frequency, MAF)显著低于对照组(20.04%vs26.64%, p=0.0335),在共显性模型中,该位点的基因型分布与T2DM显著相关[Odds ratio(OR)=0.627,95%CI(0.409,0.962),p=0.0308]。TCF7L2的rs7903146位点的基因型分布和I30/G30显著相关(OR=1.012,95%CI1.000~1.025,P0.05),在校正了性别、年龄和BMI后,TT和CT基因型携带者的I_(30)/G_(30)显著高于CC基因型携带者(P=0.0385)。T2DM组和对照组比较,TCF7L2的rs7903146和rs11196218和PCSK1的rs3811951位点的MAF和基因型分布差异均无统计学意义(P0.05)。以上SNPs位点不同基因型携带者空腹血清胰岛素原的水平均无统计学差异(P0.05),不同基因型携带者间胰岛素原/胰岛素比值的差异亦无统计学意义(P0.05)。 结论:本研究在重庆地区的汉族人群中证实了PCSK2的rs2021785位点SNPs和T2DM显著相关,TCF7L2的rs7903146可能与早相胰岛素分泌有关,但尚未发现TCF7L2的rs7903146和rs11196218、PCSK1的rs3811951位点SNPs和T2DM的相关性,亦未发现以上SNPs位点与空腹胰岛素原及胰岛素原/胰岛素比值的相关性。 目的:首先证实TCF7L2表达的转录因子在前蛋白转化酶基因的启动子上存在结合位点;其次探讨TCF7L2干扰对胰岛素原的影响及机制。 方法:通过体外培养Beta-TC-6细胞株,首先采用染色质免疫共沉淀(ChIP)技术证实TCF7L2表达的转录因子在前蛋白转化酶基因的启动子上存在结合位点;其次通过构建TCF7L2的慢病毒干扰载体,下调TCF7L2的表达,采用荧光定量PCR和Western Blotting方法检测TCF7L2和前蛋白转化酶基因mRNA及蛋白水平的变化,收集细胞培养液,采用ELISA方法测定基础和葡萄糖刺激状态下胰岛素和胰岛素原水平的变化;最后采用流式细胞仪检测TCF7L2干扰对胰岛β细胞凋亡的影响。 结果:1. ChIP实验证实:Beta-TC-6细胞中TCF4抗体免疫沉淀的ChIP产物中能扩增到PCSK1和PCSK2基因的启动子。 2. TCF7L2慢病毒干扰载体的构建及干扰效率的鉴定:酶切和测序均证实重组干扰质粒核苷酸序列插入正确,流式细胞仪测定病毒平均滴度1.2×109IU/ml。慢病毒感染Beta-TC-6细胞48小时后,在荧光显微镜下观察慢病毒感染效率达80%以上,TCF7L2干扰组TCF7L2无论是mRNA还是蛋白表达水平均显著低于对照组(P0.05,n=3)。mRNA的干扰效率约为75%,蛋白水平的干扰率约为50%。 3. TCF7L2干扰对前蛋白转化酶表达和活性的影响:①TCF7L2表达下调后,PCSK1和PCSK2基因的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P 0.05,n=3);②TCF7L2表达下调后,葡萄糖刺激的胰岛素分泌显著降低,而葡萄糖刺激后胰岛素原分泌及胰岛素原/胰岛素比值显著增加(P 0.05,n=3),提示前蛋白转化酶活性降低;③TCF7L2表达下调后,胰岛β细胞的凋亡率显著增加(P 0.05,n=5)。 结论:TCF7L2表达的转录因子在前蛋白转化酶基因的启动子上存在结合位点。TCF7L2表达下调可能通过降低前蛋白转化酶基因的表达及酶的活性,进而影响胰岛素原的加工和胰岛β的功能。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R587.1

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