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《重庆医科大学》 2011年
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耐药基因序贯移植保护骨髓及大剂量化疗的实验研究

赵利华  
【摘要】:第一部分表达MDR1的重组腺病毒载体转染骨髓单个核细胞体外实验研究1 目的:以表达人MDR1基因的重组腺病毒载体(rAd-MDR1-GFP)转染新西兰大白兔骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells,BM-MNCs),建立一套完整、稳定、高效的体外基因转染体系,评价外源性人MDR1在BM-MNCs中的功能性表达情况以及对BM-MNCs存活、增殖、细胞周期及集落形成能力等生物学行为的影响,探索转染时间、转染效率和功能性表达之间的关系,取得保证获得最高细胞转染率和最高细胞存活率的最适转染条件。为进一步研究转染rAd-MDR1-GFP的BM-MNCs序贯移植后对多疗程、大剂量表阿霉素(pharmorubicin,EADM)化疗下荷瘤动物骨髓造血功能的保护作用奠定基础。 方法:(1)采用乒乓交互感染法,以人胚肾细胞株HEK293细胞为包装细胞,收集并浓缩rAd-MDR1-GFP和rAd-GFP的病毒;(2)采用浓缩病毒转染法将外源性人MDR1导入新西兰大白兔BM-MNCs,以倒置荧光显微镜观察转染后的BM-MNCs绿色荧光蛋白(greenfluorescence protein, GFP)的表达情况;流式细胞仪技术(flowcytometry, FCM)检测rAd-MDR1-GFP对BM-MNCs的转染效率,筛选最适感染复数(multiplicity of infection, MOI);(3) RT-PCR技术(reversetranscription-polymerase chain reaction)从基因转录水平检测外源性MDR1在BM-MNCs中的表达情况;(4)免疫荧光染色法(immunofluorescence, IF)、激光共聚焦技术和免疫印记法(WesternBlotting)从蛋白质表达水平检测外源性MDR1编码蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)在BM-MNCs中的表达;(5)柔红霉素排出实验从功能水平检测外源性MDR1在BM-MNCs中的功能性表达情况;(6) MTT药物敏感实验检测MDR1转染后的BM-MNCs对EADM和长春新碱(vincristine, VCR)的耐受能力;(7) MTT法检测rAd-MDR1-GFP的转染对BM-MNCs增殖能力的影响;(8) FCM检测rAd-MDR1-GFP的转染对BM-MNCs细胞周期的影响;(9)甲基纤维素半固体培养基集落培养法检测rAd-MDR1-GFP的转染对BM-MNCs中造血干细胞集落形成能力的影响。 结果:(1)采用乒乓交互感染法收获的重组腺病毒液感染滴度达3.5×109plaque forming units (PFU)/mL;(2)成功建立了稳定、高效的rAd-MDR1-GFP体外转染体系和方法,在细胞因子合理配伍作用下、通过间隔12小时的两次病毒转染能高效率的将外源性MDR1导入新西兰大白兔BM-MNCs,转染效率达35%-45%,转染后第4天细胞存活率高、存活状态好、转染率高;(3) RT-PCR、IF和Western Bloting证实rAd-MDR1-GFP转染后外源性MDR1能在基因和蛋白水平于BM-MNCs中明显高表达;(4)柔红霉素排出实验证实导入的MDR1表达产物P-gp有药物外排泵功能;(5) MTT药物敏感实验证实转染MDR1的BM-MNCs对EADM和VCR的耐药指数(resistance index,RI)分别增高了21.1102倍和8.4786倍。(6) MTT细胞增殖实验显示外源性MDR1的转染不影响BM-MNCs的生存和增殖能力;(7) FCM检测结果提示重组腺病毒表达外源性MDR1的转染及外源性MDR1的表达不影响BM-MNCs细胞周期,不增加G2-M期细胞数量;(8)甲基纤维素半固体集落培养法证实MDR1的转染不影响BM-MNCs中造血干细胞的集落形成能力; 结论:rAd-MDR1-GFP能高效转染BM-MNCs,rAd-GFP-MDR1的转染能使外源性MDR1在BM-MNCs中功能性高表达,该转染不影响新西兰大白兔BM-MNCs的存活、增殖、细胞周期及集落形成能力等生物学特性,为进一步序贯移植经外源性MDR1修饰的BM-MNCs保护多疗程、大剂量EADM化疗下荷瘤动物的骨髓造血功能的体内实验提供了实验室依据和保障。 第二部分BM-MNCs-MDR1-GFP序贯移植对多疗程、大剂量化疗下荷瘤动物骨髓保护作用的体内实验研究 目的:探讨序贯移植经外源性MDR1修饰的BM-MNCs对多疗程、大剂量化疗下VX2肝癌荷瘤动物骨髓造血功能的长期、有效保护作用。 方法:(1)采用瘤块肝脏原位种植法建立兔VX2肝癌模型并以超声观察肿瘤的生长情况;(2)将BM-MNCs与表达MDR1的重组腺病毒浓缩液共培养4日后序贯移植至经大剂量环磷酰胺化疗预处理的VX2肝癌荷瘤兔体内;(3)每次BM-MNCs-MDR1-GFP移植后行大剂量EADM化疗实验,大剂量化疗后每周检测外周血血常规观察外源性MDR1对骨髓的保护作用,每周行超声检查以观察大剂量化疗对恶性肿瘤的杀灭作用及对非造血系统的损伤作用;(4)每次BM-MNCs移植后每周抽取骨髓和外周血获得MNCs并分别行RT-PCR和FCM以监测外源性MDR1在受体骨髓中的表达及表达时限。 结果:(1)成功建立VX2肝癌模型,成瘤率达到100%,并掌握了VX2肝癌模型的生长、进展规律;(2)采用程序性骨髓移植法将BM-MNCs-MDR1-GFP移植入荷瘤动物,BM-MNCs-MDR1-GFP能顺利多次、序贯移植至荷瘤动物;(3) BM-MNCs-MDR1-GFP序贯移植后的EADM大剂量化疗实验中,实验组荷瘤动物的外周血白细胞可维持在较高水平,有效杀灭了肝癌细胞(P﹤0.05),实验组荷瘤动物的生存时间及治愈率明显高于对照组(P﹤0.05),对照组荷瘤动物主要死于大剂量化疗所致的严重骨髓抑制和/或肿瘤扩散;大剂量化疗对非造血系统脏器有损伤;(4) RT-PCR和FCM结果提示重组腺病毒表达的外源性MDR1可在受体骨髓中定植并功能性表达约5-6周。 结论:表达外源性MDR1的重组腺病毒转染BM-MNCs后序贯移植能够长期、有效保护多疗程、大剂量化疗下荷瘤动物的骨髓造血功能。 第三部分大剂量化疗对肿瘤干细胞的杀伤性研究 目的:探讨常规剂量化疗和大剂量化疗对肝癌干细胞的杀伤性。 方法:分别收集经过常规剂量化疗和经过大剂量化疗的VX2肝癌荷瘤兔死亡后的肝内残留肿瘤组织标本,采用免疫组织化学法、免疫荧光染色法和激光共聚焦技术检测残留肿瘤组织中CD90和CD133标记的肝癌干细胞的量。 结果:免疫组织化学法、免疫荧光染色法结合激光共聚焦技术的实验结果显示大剂量化疗较常规剂量化疗对肿瘤干细胞有明显的杀伤性(P﹤0.01) 结论:大剂量化疗对恶性肿瘤肿瘤干细胞有明显的杀伤性,这可能是大剂量化疗能更有效治愈恶性肿瘤和防止恶性肿瘤复发、转移的重要机制之一。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R73-3

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【参考文献】
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