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《重庆医科大学》 2012年
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血清YB-1蛋白定量检测方法的建立及其作为肿瘤标志物的探讨

李朴  
【摘要】:目的: 1.建立基因工程制备YB-1蛋白(Y-box binding protein1,YB-1)系统,分离纯化YB-1蛋白,制备其多克隆抗体及单克隆抗体; 3.构建以化学发光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay,CLIA)为基础的YB-1定量免疫学检测技术平台; 3. CLIA定量检测人血清YB-1,并初步探讨其作为常见恶性肿瘤辅助诊断标志物的临床意义。 方法: 1.采用RT-PCR技术,从肿瘤细胞总RNA中扩增YB-1编码序列,将其克隆到pGEX-6p-1原核表达载体,构建重组表达质粒pGEX/YB-1; 2. pGEX/YB-1转化大肠杆菌BL21(DE3),确定最佳的可溶性诱导表达条件,GST亲和层析与PSP柱上蛋白酶切纯化靶蛋白; 3.将纯化的YB-1免疫动物,制备其多克隆抗体;杂交瘤法制备YB-1单克隆抗体;进一步采用B细胞抗原表位预测法初步确定单抗识别的抗原表位; 4.用制备的YB-1多抗与单抗,建立血清YB-1定量化学发光免疫学检测方法(CLIA),并对建立的CLIA法进行方法学和检测性能评价; 5.以建立的CLIA定量测定健康人、良性与恶性肿瘤患者血清中YB-1蛋白水平,并初步评价其作为常见恶性肿瘤标志物的临床意义; 6.同时与甲胎蛋白的ROC曲线比较对原发性肝癌的诊断性能。 结果: 1.采用基因克隆技术成功构建了重组载体pGEX/YB-1;经表达、分离、纯化与蛋白酶切GST,获取重组YB-1蛋白;将其免疫动物制备了YB-1多抗; 2.建立了稳定分泌mAb且能特异识别YB-1的杂交瘤细胞株(1-D9、3-E8);通过纯化制备了效价与亲和力较高的YB-1mAb; 3.杂交瘤细胞株1-D9和3-E8所分泌单抗的识别表位分别位于YB-1蛋白的(134-160aa)与(266-303aa)肽段; 4.建立了定量检测YB-1的CLIA检测方法;该法最低检测限为0.1μg/L,线性范围1.0-150.0μg/L,批内与批间变异系数分别为≤4.8和≤12.5%,平均回收率为100.6%,整个检测所需时间约90min; 5.初步确定了良性组(11.62±2.97μg/L)、恶性肿瘤组(18.69±6.11μg/L)以及健康组(10.79±2.39μg/L)血清YB-1水平;恶性肿瘤患者血清YB-1水平显著高于良性肿瘤患者及健康人(P0.0001); 6. ROC曲线显示,YB-1曲线下面积为0.896(P 0.0001),在cut-off值≥13.45μg/L的条件下,血清YB-1辅助诊断恶性肿瘤的灵敏度为80%,特异性为81%; 7. ROC曲线分析表明,在诊断原发性肝癌上,YB-1的AUC为0.901(P 0.0001),在cut-off值>14.69μg/L,血清YB-1辅助诊断原发性肝癌的灵敏度为84%,特异性为77%。而AFP的AUC为0.912(P 0.001),在cut-off值>425.0μg/L,血清AFP辅助诊断原发性肝癌的灵敏度为78%,特异性为84%。 结论: 1.成功制备了重组YB-1蛋白及其多抗与单抗,并初步确定了单抗所识别的抗原表位; 2.成功建立了具较好检测性能的血清YB-1定量检测CLIA法; 3.血清YB-1水平可作为常见恶性肿瘤辅助诊断的标志物; 4.血清YB-1诊断原发性肝癌的效能与AFP接近; 5.该研究工作为进一步评价血清YB-1作为恶性肿瘤预后判断标志物的临床评价以及该法的临床推广应用提供了良好基础。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R446.6

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【参考文献】
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