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《重庆医科大学》 2013年
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Integrinα9在人ADSCs向LECs分化过程中表达变化的相关研究

蒋娟  
【摘要】:目的从人体脂肪组织中分离培养出脂肪源性间充质干细胞(Adipose-derived stem cells, ADSCs),诱导其向淋巴管内皮细胞(Lymphatic endothelial cells, LECs)分化,同时探讨分化过程中整合蛋白α9(integrinα9)表达的变化,旨在寻找淋巴水肿分子治疗靶点,为ADSCs应用于淋巴水肿的分子治疗奠定实验基础。 方法 ①从吸脂术后废弃的人体脂肪组织中分离培养出ADSCs,倒置相差显微镜观察原代及传代细胞的形态特征。 ②流式细胞仪(FCM)检测第三代ADSCs表面特征性抗原的表达,达到鉴定ADSCs的目的;MTT法绘制生长曲线,明确传代过程中细胞生长情况是否发生改变。 ③用人血管内皮细胞生长因子C(VEGF-C)、人血管内皮细胞生长因子A(VEGF-A)、血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)诱导其向LECs方向分化,同时以人LECs作为阳性对照组。 ④Western Blot检测各组细胞LECs表面特征性抗原淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1(LYVE-1)、血管内皮细胞特征性抗原CD34及integrinα9的表达,明确实验组向LECs的分化,同时探讨integrinα9在诱导前后表达的变化。 ⑤流式细胞仪(FCM)检测各组细胞周期,分析分化前后细胞周期的改变,使用SPSS17.0对实验数据进行统计分析。 结果 ①ADSCs贴壁生长,呈长梭形,对密度的依赖性较高,传代后细胞生长速度明显增快,第1、3、5代细胞生长曲线均为典型的“S”形。 ②FCM检测抗原结果:CD29、CD90阳性表达, CD34、CD45阴性表达,与MSCs的特性相符合。 ③Western Blot结果显示:阳性对照组中LECs表面特征性抗原LYVE-1的表达为阳性,血管内皮细胞表面特征性抗原CD34为阴性表达,而integrinα9的表达与LYVE-1的表达趋势一致,亦为阳性表达;实验组LYVE-1亦为阳性表达、且CD34为阴性表达,明确了LECs的生成,integrinα9为阳性表达,同时LYVE-1及integrinα9的表达水平低于二者在阳性对照组中的表达;阴性对照组中LYVE-1、integrinα9及CD34的表达均为阴性。 ④FCM检测各组细胞周期,分析各组细胞G0/G1期细胞比例,其中实验组(65.462.73)%、阳性对照组(62.350.50)%明显小于阴性对照组(88.791.53)%,使用方差分析比较三组细胞G0/G1期细胞比例的差异(F=186.77,P﹤0.01),差异具有统计学意义。SNK法进行两两比较,实验组G0/G1期百分比显著小于阴性对照组(q=22.06,P﹤0.05),差异具有统计学意义;阳性对照组G0/G1期百分比显著小于阴性对照组(q=25.01,P﹤0.05),差异具有统计学意义。实验组与阳性对照组之间G0/G1期百分比无明显差异(q=2.94,P=0.083﹥0.05)结论 ①ADSCs贴壁生长、长梭形,原代培养时细胞呈现明显的集落生长趋势,且对密度的依赖性高,传代后细胞增殖速率明显增强,传代后细胞的形态及生长情况不发生明显改变,传代后细胞的纯度较高可用于ADSCs向LECs分化的研究。 ②使用VEGF-A、VEGF-C及PDGF-BB可成功将ADSCs诱导分化为LECs(LYVE-1表达阳性、CD34表达阴性,证实了LECs的 生成),ADSCs具有向LECs分化的潜能,在对各组细胞周期进行检测的时候我们发现,分化前后细胞的周期发生了改变,处于G0/G1期的细胞比例明显减少。 ③Integrinα9在LECs中的表达趋势与LYVE-1的表达相一致,作为prox1基因下游调节关键因子,其在LECs的形成过程中可能发挥着极其重要的作用,该分子有望在淋巴水肿的再生治疗中成为重要的分子靶点之一,但Prox1-integrinα9信号通路的具体调节机制目前还并不清楚,有待进一步深入研究。
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R329.2

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